[发明专利]高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法，包括如下步骤：1) 以二价和三价铁盐的混合物共沉淀制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子，以硅烷偶联剂进行修饰，并在修饰后的微粒外表以戊二醛活化，从而得到表面活化的磁性纳米粒子；2)将纯化脱盐后的醛缩酶缓冲液和磁性载体在低温下搅拌、洗涤、冷冻干燥后得到磁性纳米载体固定化醛缩酶；3)采用该磁性纳米载体固定化醛缩酶为催化剂催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，得到3-磷酸甘油醛和乙醛．本发明所涉及的固定化醛缩酶在催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸反应中，底物乙醛耐受性显著提高，酶的回收利用操作极大简化。

主权项

一种高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于它的步骤如下：1) 向250mL无氧水中加入0.25~0.35mol三价铁盐和0.15~0.2mol二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1~2，超声处理 30‑40 min；升温至 70~85 ℃，在 1 200~ 1 400 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 25~30 min，加入9~10 mL 质量百分数 25~28%的氨水或 10 ~15mL 10mol/L NaOH，使溶液 pH = 8‑10，20~30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 5~10 次，再以 0.010~0.015mol/L 乙醇水溶液洗涤 3~4 次；2) 加入80~100 mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，6~8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、180~220 rpm搅拌 5~6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；3) 加入18~20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及18~20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm搅拌2~3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；4）配制1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为：1: 1~5，在冰浴中，pH调整至5‑10，200rpm，搅拌3‑12h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液的蛋白浓度；5）将10mg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2~12h，再加入到1ml的50mM 的三乙醇胺盐酸盐溶液，其pH为7.5，含0.1mmol 的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸， 0.4mmol 的底物2‑脱氧‑D‑核糖‑5‑磷酸，4U/ml 磷酸丙糖异构酶，11U/ml 甘油磷酸脱氢酶, 50℃条件下反应后检测340 nm 处吸光度的变化。