[发明专利]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌Apx I C基因缺失突变株、构建方法、疫苗及应用

摘要

本发明公开了一种无抗性标记的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠC基因缺失突变株，该疫苗候选株的株号为SW1ΔⅠC，于2011年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2011300；利用基因工程手段将毒素ApxⅠ的激活基因C缺失，缺失的片段大小为475bp。本发明所构建的基因缺失株遗传稳定，不会返强。本发明还利用该基因缺失株制备了基因缺失弱毒疫苗，同时通过小白鼠、仔猪的免疫效力试验证明该疫苗能诱导良好的免疫保护。

主权项

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠC基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：构建重组转移载体pBOSKΔⅠC；所述步骤A具体操作如下：A1，构建APP正负筛选表达盒，操作步骤如下：A11，APP外膜蛋白启动子序列(OmlaP)的扩增、TA克隆及鉴定：根据已发表序列(Genbank，NC_009053)设计引物Po‑1和Po‑2，以APP血清5型基因组DNA为模板，PCR扩增Omla基团上游的266bp启动子序列；将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19‑TSimple载体上，获得重组质粒pMD19‑OmlaP；A12，果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的扩增、TA克隆及鉴定：根据已发表序列(Genbank，NC_000964)设计引物Ps‑1和Ps‑2，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增sacB基团；将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19‑TSimple载体上，获得重组质粒pMD19‑sacB；A13，卡那霉素抗性基因(Kanr)的扩增、TA克隆及鉴定：根据已发表序列(Genbank，U55763.1)设计引物Pk‑1和Pk‑2，以质粒pEGFP‑N1 DNA为模板，PCR扩增Kanr基因；将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19‑TSimple载体上，获得重组质粒pMD19‑Kanr；A14，正负筛选表达盒(OSK)在pBluescriptⅡSK+载体中的构建：pVAX‑OmlaP的构建：pVAX1经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后回收大片段，pMD19‑OmlaP经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接，以重组质粒为模板，用引物Po‑1、Po‑2为引物进行PCR鉴定正确，再用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定；PCR和酶切鉴定都正确的质粒命名为pVAX‑OmlaP；A15，pVAX‑OK的构建：pVAX‑OmlaP经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后回收大片段，pMD19‑Kanr经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接，以重组质粒为模板，用引物Pk‑1、Pk‑2进行PCR鉴定，再BamHⅠ和KpnⅠ酶切鉴定。PCR和酶切鉴定正确的命名为pVAX‑OK；A16，pBS‑OK的构建：pBluescriptⅡSK+经XhoⅠ和KpnⅠ酶切后回收大片段，pVAX‑OK经XhoⅠ和KpnⅠ酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接，以重组质粒为模板，用引物Po‑1、Pk‑2进行PCR鉴定，再用XhoⅠ和KpnⅠ酶切鉴定；PCR和酶切鉴定正确的命名为pBS‑OK；A17，pBS‑OSX的构建：pBS‑OK经HindⅢ和SpeⅠ双酶切后回收大片段，PVAX1经HindⅢ和SpeⅠ双酶切后回收大小为662bp的小片段，回收的两个片段进行定向连接，用HindⅢ和SpeⅠ酶切鉴定；将酶切鉴定正确的命名为pBS‑OKX，连入此片段的目的是利用PVAX1上的小段消除pBS‑OK载体多克隆位点上HindⅢ到SpeⅠ之间的BamHⅠ位点，以方便sacB连接到载体上，该片段将在后面连入右同源臂时被替换出去；A18，pBS‑OSK的构建：pBS‑OKX经BglⅡ和BamHⅠ双酶切后回收大片段，由于BglⅡ和BamHⅠ是同尾酶，连时会发生自载体身连接，载体酶后用去磷酸酶Alkaline Phosphatase(CIAP)处理，同时pMD19‑sacB经BglⅡ和BamHⅠ双酶切后回收小片段；回收的两个片段连接后转化到大肠杆菌DH5α中，以重组质粒为模板，用引物Ps‑1、Ps‑2进行PCR鉴定，再BglⅡ和BamHⅠ酶切鉴定；PCR和酶切鉴定正确的命名为pBS‑OSK，载体上的OmlaP、sacB、Kanr三个片段结合在一起形成正负筛选表达盒；A2，构建左同源臂和右同源臂，具体操作如下：A21，左同源臂的扩增及TA克隆：根据已发表序列(Genbank，NC_009053)设计引物Pl‑1和Pl‑2，以APP血清5型基因组DNA为模板，PCR扩增的ApxⅠC基团上游的2895bp序列；将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19‑TSimple载体上，获得重组质粒pMD19‑L；A22，右同源臂(R)的扩增及TA克隆：根据已发表序列(Genbank，NC_009053)设计引物Pr‑1和Pl‑2，以APP血清5型基因组DNA为模板，PCR扩增的ApxⅠA基团上游的1434bp序列；将纯化的PCR扩增产物克隆到pMD19‑TSimple载体上，获得重组质粒pMD19‑R；A23，左右同源臂连接到pBS‑OSK载体中，构建最终载体pBOSKΔⅠC：pBOSKR的构建：pBS‑OSK经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后回收大片段，pMD19‑R经Spe Ⅰ和SalⅠ双酶切后回收小片段，回收的两个片段进行定向连接，以重组质粒为模板，用引物Pr‑1、Pr‑2为进行PCR鉴定；再用SpeⅠ和SalⅠ酶切鉴定；PCR和酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKR；载体pBOSKR中氨苄抗性基因的消除：用DNAMAN分析发现载体上卡那霉素抗性基因的两端各有一个PvuⅠ酶切位点，用PvuⅠ酶切可以将载体切成两段，大小分别约为5869bp和1045bp回收大片段，经连接后转化到大肠杆菌DH5α中，挑选在含有卡那霉素的LB平板生长，不能在含有氨苄的LB平板生长的菌落在含有卡那霉素的LB液体培养后提取质粒，用PvuⅠ酶切鉴定；将酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKR(A‑)；pBOSKΔⅠC的构建：pBOSKR(A‑)经SacⅠ和SpeⅠ双酶切后回收大片段，pMD19‑L先用PvuⅠ酶切后回收大片段后再用SacⅠ和SpeⅠ双酶切后回2895片段，将回收的两个片段进行定向连接，以重组质粒为模板，用引物Pl‑1、Pl‑2为引物进行PCR鉴定，再用SacⅠ和SpeⅠ酶切鉴定。PCR和酶切鉴定都正确的质粒命名为pBOSKΔⅠC；A3，重组转移载体pBOSKΔⅠC的测序鉴定；步骤B：构建基因缺失株SW1ΔⅠC，具体操作如下：B1，重组菌的正向筛选：将重组转移载体pBOSKΔⅠC电转化到APP血清5型SW1，在含有Kan的TSA平板上筛选Kan抗性菌落，将Kan抗性菌落转印到含10％蔗糖的TSA平板上证实菌落对蔗糖的敏感性，筛选对Kan抗性、蔗糖敏感的菌落做PCR鉴定；B2，重组菌的负向筛选：从步骤B1鉴定正确的一个对Kan抗性、蔗糖敏感的菌落在没有抗性的TSB培养基中培养过夜，促进第二次同源重组；培养液然后以大约每个平板长出100个菌落的浓度把过夜培养液涂布到含有10％蔗糖TSA平板上，筛选蔗糖抗性菌落。再将具有蔗糖抗性的菌落转印到含有Kan的TSA的平板，鉴定对Kan的敏感性。筛选对Kan敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鉴定，最终筛选到一株鉴定正确的ApxⅠC基因缺失突变株。