[发明专利]一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法

摘要

本发明公开了一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法。该方法选取液氮法充分研磨组织，然后采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白质，通过使用含有二硫苏糖醇和三氯乙酸的预冷丙酮溶液沉淀蛋白并用含有二硫苏糖醇的预冷丙酮溶液数次洗涤沉淀，最后通过加入样品裂解液制备出适合双向电泳的高质量的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。本发明制备出双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且实验重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

主权项

一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：包括以下步骤：（1）称取克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织500 mg，放入预冷至0~ 20℃的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15 mL离心管中；（2）向步骤（1）中的15 mL离心管中加入上述克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织4~6倍体积的、冰水混合液中预冷至0℃的、以丙酮为溶剂的溶液A，充分混匀，于0~ 20℃放置2~4h，0~20℃、12000~15000 r/min离心20~30min，收集所得沉淀物；所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为：0.01~0.03 mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为15%~20%的三氯乙酸；（3）向步骤（2）所得沉淀物中加入2 mL 冰水混合液中预冷至0℃的以丙酮为溶剂的溶液B，充分混匀，于0~ 20℃放置2~4h，0~ 20℃、12000~15000 r/min 离心20~30 min，收集所得沉淀物；用上述以丙酮为溶剂的溶液B重复清洗沉淀一次，于0~ 20℃低温静置挥发残留丙酮3~5 h，得蛋白沉淀；所述以丙酮为溶剂的溶液B中的溶质为：0.01~0.03 mmol/L 的二硫苏糖醇；（4）向步骤（3）中制得的蛋白沉淀中加入600 L的样品裂解液，室温下充分裂解2~3 h，得蛋白质混合液；所述样品裂解液以体积百分含量0.5%~1%的IPG缓冲液为溶剂，其中含有6~8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0.002 g/mL的溴酚蓝；（5）将步骤（4）中蛋白混合液于4~6℃、12000~15000r/min 离心20~30 min，收集上清液，即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。