[发明专利]一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法

摘要

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤：A．大麦茎尖培养及载体构建：1）选取大麦颖果，去除稃片，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2）从中间载体pMBL-3及和绿色荧光蛋白基因GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，步骤：1）大麦茎尖的获取；2）茎尖的浸染；3）茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液；4）茎尖的恢复培养基；5）茎尖的筛选培养基；6）再生植株的春化和栽培，得到候选的转化植株。方法易行，操作简便，周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。

主权项

一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤是：A、大麦茎尖培养及载体构建：1)选取大麦颖果，去除稃片，用70％v/v乙醇浸泡3min，然后用0.1％w/vHgCl2浸泡13～15min，无菌水冲洗3‑5次每次1‑3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、室温萌动15‑17h，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2)从中间载体pMBL‑3及和绿色荧光蛋白基因GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列，克隆连接到以pUC18的载体上，构建形成了pMBL9植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，它包括以下步骤：1)、大麦茎尖的获取：取大麦成熟胚在21‑24℃萌发生长3‑5天的幼苗，除去幼苗的根、盾片及幼叶，留下4‑6mm的茎尖，用针刺伤生长点，置于高渗培养基上处理1‑3小时；2)、茎尖的浸染：从步骤1)得到大麦茎尖，加入用农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌GV3101菌液，浸染茎尖24‑26min，超声波处理14‑16s；3)、茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于21‑24℃共培养1‑3天；4)、茎尖的恢复培养基：将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于23‑27℃下培养6‑8天；5)、茎尖的筛选培养基：将恢复培养后的茎尖转到筛选培养基上筛选2‑4轮，每轮9‑11天；6)、再生植株的春化和栽培：将筛选获得的阳性苗转至生根培养基上9‑11天，再春化处理2周后，移栽到土钵中，于生长室中培养，23‑27℃，2000Lux，光照培养至移栽，得到候选的转化植株；所述的萌发培养基：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8；所述的高渗培养基：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5，1g/L水解酪蛋白，0.69g/L L‑脯氨酸，0.4mol/L甘露醇+6g/L琼脂粉，pH 5.8；所述的农杆菌浸染培养基：190mg/L KNO3，165mg/L NH4NO3，17mg/L KH2PO4，37mg/L MgSO4·7H2O，44mg/L CaCl2·2H2O，2.78mg/L FeSO4·7H2O，3.73mg/L Na2·EDTA，0.083mg/L KI，0.62mg/L H3BO3，2.23mg/L MnSO4·4H2O，0.86mg/L ZnSO4·7H2O，0.025mg/L Na2MoO4·2H2O，0.125mg/L CuSO4·5H2O，0.0025mg/L CoCl2·6H2O，0.2mg/L甘氨酸，0.1mg/L VB1，0.05mg/L VB6，0.05mg/L VB5，200mg/L L‑脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，100mg/L Vc，1.95g/L MES，45g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，40μL/L L‑77，0.5g/L谷氨酰胺，pH 5.2。使用时加1‰ 1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌；所述的共培养培养基：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5+0.69g/L L‑脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.2，使用时加1‰ 1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌；所述的恢复培养基：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5+0.69g/L L‑脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加入500mg/L头孢霉素；所述的筛选培养基：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5+0.69g/L L‑脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加2mg/L PPT和500mg/L头孢霉素。