[发明专利]微量黄体生成素检测方法

摘要

本发明公开了一种微量黄体生成素检测方法。包括（1）无黄体生成素血清的制备：（2）睾丸间质细胞的准备：（3）受检者血清样品中黄体生成素的分析：（4）将睾酮的检测结果在黄体生成素标准曲线上反算，查出待测样本中黄体生成素浓度。可以检测极低浓度LH；本发明的方法灵敏度大大提高；比现有睾丸细胞法比放免法敏感100倍，比化学发光法敏感1000倍。

主权项

一种微量黄体生成素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（一） 无黄体生成素血清的制备：将硅橡胶管塞满雌二醇结晶，皮下植入豚鼠背部4‑6周用以抑制动物黄体生成素的分泌，收集50毫升血清，加入10‑20mg的活性炭，在室温下吸附12小时，用滤纸过滤除去甾体激素，滤液存于‑30℃冰箱中保存；（二）睾丸间质细胞的准备：取动物睾丸2个去包膜，将2个睾丸放于6.2ml 199培养液中，再加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0.28mg/ml；分离酶II的最终浓度为0.14μ/ml；在37℃孵育20分钟，所得悬浮液用等量培养液稀释，过滤后加入聚蔗糖，使其浓度为13g/100mL，离心分离；将含睾丸间质细胞的沉淀加入到3‑4mL199培养液中,再加入1‑2mL磷酸盐缓冲液稀释,再进行重悬；然后，加入3‑异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清，加入量是：3‑异丁甲基黄嘌呤为0.125mMol；牛血清蛋白为0.5g/100mL；胎牛血清为总体积的2%；用台酚蓝排除法做活细胞计算；（三）受检者血清样品中黄体生成素的分析：（A）血清样品中的黄体生成素刺激睾丸间质细胞产生睾酮：取100μl上述睾丸间质细胞悬液加入受检者血清50μl；或者50μl磷酸盐缓冲液稀释过的黄体生成素标准品（其中含有与受检者标本等量但无黄体生成素的血清），在37℃，用5% CO2 和95%O2孵育4小时后，加入1.5ml含0.01g/100mL硫柳汞明胶磷酸盐缓冲液以终止反应；（B）睾酮的检测：将上述血清样品及标准品按照现有睾酮检测试剂盒或其它方法进行睾酮的检测：并在标准曲线上，查出待测样本中睾酮的浓度；（四）黄体生成素浓度的推算：将睾酮的检测结果在黄体生成素标准曲线上反算，查出待测样本中黄体生成素浓度。