[发明专利]一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法包括线形打靶DNA的设计和制备、含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和减毒活疫苗的制备。本发明所述抗弧菌病的减毒活疫苗是对拟态弧菌外毒素基因进行剔除后得到的，可以产生较好的免疫保护性，其免疫保护率可达84％。本发明抗弧菌病的减毒活疫苗可用于免疫多种海水养殖鱼类，可提高鱼类产量，适合推广应用。

主权项

一种抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括线形打靶DNA的设计和制备、含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和制备减毒活疫苗；其中，所述线形打靶DNA的设计和制备是：设计一对引物，引物序列如SEQ ID NO：1～2所示，一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因5’端同源3’端与卡那霉素抗性基因的一端同源；另一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因3’端同源，3’端与卡那霉素抗性基因的另一端同源；以含卡那霉素抗性基因的质粒为模板，通过PCR扩增出中间未卡那霉素抗性基因、两端为40～50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。