[发明专利]一种猪精液冷冻保存方法

摘要

本发明公开了一种猪精液冷冻保存方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；2)精液稀释；3)精液预冷平衡；4)精液的滴冻；5)精液解冻和冻后活力检查。本发明的益效是：本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。

主权项

一种猪精液冷冻保存方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1.1)猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1.1.1)常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na2 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸链霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L；1.1.2)冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20％(v/v)、甘油6％(v/v)即为冷冻稀释液；1.2.)稀释液的配制1.2.1)常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用；1.2.2)冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1～2只，先用75％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液10ml时，取常温稀释液7.4ml，卵黄上清2ml，甘油0.6ml混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用；2)精液稀释2.1)常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1∶1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室；2.2)冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀释后，检查活力，如精液活力≥0.7即可进行精液预冷平衡；3)精液预冷平衡把稀释好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h；4)精液的滴冻把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，10min后把颗粒铲进液氮中；5)精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1～2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37℃恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。