[发明专利]一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法

摘要

本发明公开了一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法。本发明首先根据抗菌肽Cecropin A氨基酸序列的特点，设计了新的抗菌肽基因，在序列的5’端加入了组氨酸标记序列，两端分别加入了Xho I和Not I酶切位点序列，合成其序列；其次将获得产物克隆至T载体；第三是将目的基因构建于酵母表达载体pPIC9k，构建成含目的基因的重组载体pPIC-CEC；第四是将其转化于毕赤酵母GS115中表达，形成了抗菌肽基因转化毕赤酵母工程菌GS115(pPIC-CEC)。该菌株可以表达产生基因工程抗菌肽Cecropin A，该菌成本低，大规模发酵生产方便，易于实现产业化，本发明操作方法简单，易于观察，重复性好，表达产物将来可应用于水果采后生物防治，可以带来一定的经济效益。

主权项

一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)根据注册号为AAA29185的抗菌肽CecropinA基因序列，进行全序列合成，同时分别引入组氨酸标记序列及限制性酶切位点NotI和XhoI，得到抗菌肽Cecropin A基因合成产物；2)将抗菌肽Cecropin A基因合成产物克隆于pGEM-T载体，得到重组载体pGEM-T-CEC，将重组载体pGEM-T-CEC转入大肠杆菌DH5α中，得到DH5α(pGEM-T-CEC)菌株；3)从DH5α(pGEM-T-CEC)菌株中提取重组载体pGEM-T-CEC质粒，用NotI和XhoI双酶切质粒pGEM-T-CEC得到目的片段Cecropin A；同样酶切酵母穿梭载体pPIC9k使其线性化，将线性化后的pPIC9k载体与双酶切后得到的CecropinA在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC-CEC，将该重组载体转入大肠杆菌心DH5α中得到DH5α(pPIC-CEC)菌株，并对其进行PCR及酶切鉴定；4)从DH5α(pPIC-CEC)菌株中提取重组质粒pPIC-CEC，用SalI酶切成线性，利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC-CEC转化毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中，涂于MD平板上。在30℃孵育平板2-3d，克隆长出，得到酵母基因工程菌株GS115/CEC，对酵母基因工程菌株GS115/CEC进行表型和拷贝数鉴定；5)用灭菌牙签挑取单克隆，在MM和MD平板上对应位置点转化子，确保先在MM平板上点。寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株，即为Muts表型，而生长无差异即为Mut+表型；6)挑取约500个转化子在浓度由低到高的G418浓度的YPD平板上点样鉴定。