[发明专利]小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，包括如下步骤：花药愈伤组织诱导；高渗培养；基因枪轰击转化；恢复培养；分化筛选培养；壮苗、生根培养；染色体加倍；分子检测并筛选。与传统的体细胞愈伤组织基因抢转化相比，本发明的基因枪轰击后的花药愈伤组织再生频率高，再生株经染色体加倍后可直接获得转基因纯合稳定株，克服了传统的体细胞愈伤组织基因抢转化中，愈伤组织再生频率低、转化株基因杂合，须经自交2代选择纯合体的技术弊端，提高了小麦遗传转化和分子育种效率，转化效率达8％以上。

主权项

一种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)小麦花药愈伤组织诱导：选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在2℃～4℃条件下低温放置2天；低温放置后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在花药愈伤组织诱导培养基上，于25℃～27℃条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组织；所述的小麦花药愈伤组织诱导培养基以通用培养基W14为基准，添加以下物质：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)：2.0mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：100000mg/L，琼脂粉：5000mg/L；调整花药愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；2)高渗培养：小麦花药组织诱导培养40天后陆续产生花药愈伤组织，分批挑选小米粒大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到高渗培养基中培养5h；所述的高渗培养基为愈伤组织诱导培养基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；3)基因枪轰击转化：经高渗培养后的花药愈伤组织用常规的基因枪转化方法进行轰击转化，基因枪轰击参数为：金粉直径1.0μm，阻挡网与轰击材料之间的距离为6.0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1μg/60μg，每皿材料轰击1次；4)恢复培养：基因枪轰击后的花药愈伤组织在上述高渗培养基上继续培养8h，然后转移到小麦花药愈伤组织诱导培养基上恢复培养6h；5)分化筛选培养：恢复培养6h后的花药愈伤组织转至分化筛选培养基上进行光照分化筛选培养；培养温度为25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；所述的分化筛选培养基选用通用培养基W14，以通用培养基W14为基准，添加以下物质：6-呋喃基氨基嘌呤(KT)：2.0mg/L，α-奈乙酸(NAA)：0.1mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，琼脂粉：5000mg/L；调整分化筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2)灭菌20分钟；经基因枪轰击、恢复生长的花药愈伤组织在分化筛选培养基上分化出芽苗。6)壮苗、生根培养：待花药愈伤组织分化的芽苗长至2～3片叶时转移到生根、壮苗培养基上，于25℃、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养；所述的壮苗、生根培养基以通用培养基W14为基准，并将W14通用培养的无机盐浓度降低一半，添加α-奈乙酸(NAA)：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，琼脂粉：5000mg/L；调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；7)染色体加倍：在壮苗、生根培养基上根、苗生长健壮的花粉植株及时移栽到营养钵中，于15℃、1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长10天后，用含0.05％的秋水仙素和1.5％的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍，注射在清晨8～10时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株经染色体加倍后得到加倍纯合个体；8)分子检测并筛选：用常规的分子检测技术对加倍纯合个体进行分子检测，筛选稳定的转基因纯合株。