[发明专利]一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法

摘要

一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，涉及一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。本发明解决了现有酶生物传感器受环境影响造成酶活性丧失，造成假阳性；酶的价格昂贵，不可逆反应造成生物传感器无法多次使用，仪器成本过高；选择性不高等问题。一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤为：首先对鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行提取分离、纯化，然后采用壳聚糖将鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行固定化，制备出固定化乙酰胆碱酯酶膜，即得酰胆碱酯酶荧光生物传感器。本发明制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有不需连接外部电源、不用参考电极、体积小、质量轻、响应速度快、抗电磁干扰、防腐蚀、灵敏度很高、测量带宽很宽、操作简便、成本低廉等优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。

主权项

1、一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤如下：一、乙酰胆碱酯酶的提取：1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放入表面皿中称重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/LNaCl的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0～4℃离心(10000r/min)10min。二、纯化：1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆碱酯酶固定化：壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶：取0.2g壳聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室温下磁力搅拌5～10min，至形成黄色溶胶。4℃，10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于该溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值为8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50μl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚糖膜两面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃进行交联，取出膜，用PBS将多余的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。