[发明专利]天然抗菌剂鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法。本发明采用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β-防御素(AvBD)9基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭AvBD 9重组蛋白。进一步研究发现，鸭AvBD 9重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明的方法得到的重组鸭AvBD 9重组蛋白的有益效果有：1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀金黄色葡萄球菌活性不变。

主权项

1、一种天然抗菌剂鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法，其特征在于：(1)根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物：5′-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3′，下游引物：5′-TTAGGAGCTAGGTGCCCATTTGCAGC-3′；(2)采用RT-PCR方法从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因并克隆到pMD-T载体上，经序列测定得如下基因序列：ATG AGA ATC CTT TTC TTC CTT GTT GCT GTT CTC TTC TTC CTC TTC CAG GCT GCTCCA GCT TAC AGC CAA GAA GAC GCT GAC ACC TTA GCA TGC AGG CAG AGC CACGGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG ACC TGCCGT GGT GGG AAG CTG AAA TGC TGC AAA TGG GCA CCT AGC TCC TAA(3)根据鸭AvBD9基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建重组表达载体pGEX-6p-1-AvBD9，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；(4)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-6小时内，每2小时分别采1ml菌样，并分别于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液体积的1×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟，进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的杆品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度为5％，分离胶为12％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量30kD的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD9特异蛋白，蛋白质的表达量为34％；(5)经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD9重组蛋白，并在体外测定鸭AvBD9重组蛋白的抗菌作用与理化特性，研究发现鸭AvBD9重组蛋白：1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀金黄色葡萄球菌活性不变。