[发明专利]天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法。本发明用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β-防御素(AvBD)2基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭AvBD2重组蛋白。进一步研究发现，鸭AvBD 2重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明的方法得到的重组鸭AvBD 2重组蛋白的有益效果有：1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀菌活性不变。

主权项

1、一种大然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法，其特征在于：(1)根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物：5`-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3`，下游引物：5`-CGCAATGGCAATTTATTC-3`；(2)采用RT-PCR方法从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因并克隆到pMD-T载体上，经序列测定得如下基因序列：atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctctgtaggaaag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgctttgggt tccgctcctg ctgcaaatcgccatgggatg tataa(3)根据鸭AvBD2基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将鸭AvBD2基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建重组表达载体pGEX-6p-1-AvBD2，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；(4)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-7小时内，每小时分别采1ml菌样，并分别于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液体积的1×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟，进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的样品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度为5％，分离胶为12％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量30kD的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD2特异蛋白，蛋白质的表达量为38％；(5)经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD2重组蛋白，并在体外测定鸭AvBD2重组蛋白的抗菌作用与理化特性，研究发现鸭AvBD2重组蛋白：1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀菌活性不变。