[发明专利]一种水环境病毒高效、快速的富集方法

摘要

本发明公开了一种水环境病毒快速而高效的富集方法。由以下步骤组成：(1)向1ml检测样本中加入病毒纳米免疫磁颗粒悬液2μl，吸附20分钟；(2)在35℃，磁板吸引2分钟；(3)弃上清后用含体积百分比为0.05％的吐温-20的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液1.0ml洗涤一次，加入0.1ml生理盐水制成悬液，即可获得富集的病毒，本发明可使病毒回收率达70％以上，回收灵敏度为50PFU/ml。本发明涉及的纳米免疫磁颗粒用于富集水环境中的病毒，具有快速、高效、效果稳定的优点。

主权项

一种水环境病毒高效、快速的富集方法，其特征是包括如下步骤：①葡聚糖纳米磁颗粒的制备：a.将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮气氛围下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T 40水溶液中，所述葡聚糖T 40水溶液的浓度为g/ml百分比浓度，50～70℃，水浴10～30分钟，在150～500转/分钟的搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35 45ml，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液；b.将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0 8.0；c.将悬液中的聚集体在600×g下离心10～20分钟去除游离的葡聚糖后，经聚丙烯酰胺葡聚糖S 300凝胶层析柱过滤获得葡聚糖纳米磁颗粒，其中洗脱平衡液为pH为6～8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒经冷冻干燥，最后获得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；d.取葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/LNaIO4水溶液0.25ml，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时后，加入1～3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml终止氧化，用pH为6～8的0.005 0.02mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析18～48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml；②纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的病毒抗体，混匀后，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液还原10～60分钟，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S 300凝胶层析柱过滤与结合物分离，制成特定病毒的纳米免疫磁颗粒悬液。③分离、浓集水环境中病毒在1ml检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，吸附3～20分钟，在15～35℃，磁板吸引2 10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温 20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液0.5～1.0ml洗涤一次，加入0.1ml生理盐水即可制成浓集的病毒悬液。