[发明专利]玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法

摘要

本发明涉及一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法，取新月弯孢霉菌种扩大培养后配制成原生质体悬浮液，取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接种培养后提取质粒DNA，并配制酶－质粒混合液，将原生质体悬浮液与酶－质粒混合液混匀，培养筛选得到突变体后再经不含潮霉素和含潮霉素的PDA上培养，筛选获得稳定的玉米弯孢叶斑病菌突变菌株。本发明采用限制性内切酶介导的基因整合技术，将质粒DNA与制备的木霉菌原生质体混合，并在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱导插入突变。获得的突变株为筛选弱致病性弯孢菌株提供了丰富的筛选菌源，可用于克隆玉米弯孢菌致病性相关基因及研究玉米弯孢菌菌株致病机理。

主权项

1、一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法，其特征在于包括如下具体步骤：1)取新月弯孢霉菌种在PDA培养基上培养后，配制成孢子悬浮液；将孢子悬浮液加入到麦芽汁培养液中，孢子悬浮液与麦芽汁培养液的体积比为1-3∶100；每升麦芽汁培养液含葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，磷酸氢二钾5g，以12Brix的麦芽汁配制，调节pH6.0；振荡培养，离心收集菌体，再用无菌水冲洗，离心收集获得新月弯孢霉菌体，利用新月弯孢霉菌体配制成原生质体悬浮液；2)取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至对数生长期后置于离心管中，离心，提取质粒DNA；3)在离心管中加入质粒DNA 38-42μg、浓度为10个单位/微升的限制性内切酶HindIII10μL、CaCl2溶液200μL，配制成酶-质粒混合液，然后向离心管中加入100-200μL原生质体悬浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上15-20min；向离心管中加入2mL 60％聚乙二醇，冰浴20-25min，然后将离心管取出在28℃下放置10-20min；加入5mL预冷的CaCl2溶液，4℃下离心，弃上清，加入3mL麦芽汁培养液，30℃下放置6-7h；将离心管中的混合液倒入培养皿中，然后加入预先熔化好并冷却至45-50℃的再生培养基，使混合液与再生培养基混匀；所述再生培养基每升含葡萄糖10g、酵母膏5g、0.6mol KCl、琼脂粉10g，以6Brix麦芽汁配制，调节pH为6.0；再生培养基冷却凝固后，加入潮霉素浓度为300毫克/毫升的水琼脂培养基10-12mL；将培养皿在28-30℃下培养4-5d，将长出的菌落转移到含有250毫克/毫升潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，得到突变体；4)将二次筛选后得到的突变体转接到不含潮霉素的PDA上，培养长出菌落后，继续转接到不含潮霉素的PDA上培养，如此重复若干次后，再转接到含潮霉素的PDA上培养，筛选出稳定突变的菌株，即获得玉米弯孢叶斑病菌突变菌株。