[发明专利]一种地西泮人工抗原的制备方法

摘要

一种地西泮人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明第一步为半抗原的制备及检测：以地西泮，丁二酸酐为原料，利用付－克酰化反应在地西泮的5位苯环上引入羧基；第二步为人工抗原的制备及检测：利用混合酸酐法使之与牛血清蛋白结合制备地西泮的人工抗原即地西泮－牛血清蛋白。本发明合成了地西泮的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

主权项

1.一种地西泮人工抗原的制备方法，其特征是以地西泮，丁二酸酐为原料，利用付-克酰化反应在地西泮的5位苯环上引入羧基；利用混合酸酐法使之与牛血清蛋白结合制备地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白；步骤为：1)人工半抗原的制备：地西泮和丁二酸酐配料摩尔比为1∶1，分别称取无水氯化铝2.5mmol和丁二酸酐1mmol于50mL圆底烧瓶中，加入10mL硝基苯，40℃条件下搅拌至固体完全溶解；另称取地西泮1mmol，分3次加入上述的反应液中，反应温度逐渐提高至70℃，反应过夜；在剧烈搅拌下，将反应液倾入适量冰水中，静置分层后，取有机层进行减压蒸馏，得到的残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出沉淀，过滤、干燥得到0.8mmol半抗原备用；反应终点监测：采用薄层层析法进行监测，硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲苯∶乙醚∶乙酸∶甲醇，体积比为60∶30∶9∶1，展开至薄板0.35-0.4cm处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点作为反应终点；2)人工抗原的制备：制备A液：称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入5mL二氧六环和0.2mL的三乙胺，冷却至5℃；然后加入0.15mL氯甲酸异丁酯，低温下搅拌1h，此液为A液；制备B液：称取0.003mmol的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL二氧六环的溶液中，并用1N的氢氧化钠调节pH8-9，低温保存，此液为B液；在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在8-9；4℃条件下，搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：地西泮-牛血清蛋白。