[发明专利]基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法

摘要

本发明是一种基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法。本发明是从黑曲霉(Aspergillus niger var niger strain N402)中分离出木聚糖酶基因，在真核表达系统毕赤酵母中高效表达。使用了黑曲霉Aspergillus niger var niger strain N402木聚糖酶基因，采用了毕赤酵母表达载体PGAP Z alpha A和宿主菌株巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)SMD1168、GS115，所构建的基因工程酵母具有生产耐高温木聚糖酶的能力，所构建的基因工程酵母除具有宿主菌株SMD1168和GS115的形态、遗传和生理生化特征外，还包含黑曲霉Aspergillus niger var nigerstrain N402木聚糖酶基因，具有生产耐高温木聚糖酶的能力。本发明中基因重组毕赤酵母生产的耐高温木聚糖酶具有极好的耐热特性，在100℃条件下加热处理5分钟后，仍具有65％的残余酶活，而且其最适作用温度范围为37～50℃，在动物的胃中能较好的发挥催化作用，本发明所生产的耐高温木聚糖酶特别适合应用于饲料工业。

主权项

1.一种基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法，其特征在于按以下步骤进行：1)工程菌的构建：(1)黑曲霉基因组DNA的提取；(2)采用PCR反应从黑曲霉基因组DNA中克隆木聚糖酶基因片断，引物和反应条件如下：引物1(F)：5′-cggaattcgctcctgtgccggaacctg-3′引物2(R)：5′-cggaattcagaggagatcgtgacactggcgcg-3′反应条件为：94℃变性1min，50℃复性1min30s，72℃延伸2min30s，30个循环后，72℃保温20min，得黑曲霉木聚糖酶基因序列：cggaattctggtgtcgcgaagtgctggtattaactacgtgcaaaactacaacggcaaccttggtgatttcacctatgacgagagtgccggaacattttccatgtactgggaagatggagtgagctccgactttgtcgttggtctgggctggaccactggttcttctaagtgagtgactgtattctttaaccaaagtctaggatctaacgttttctagcgctatcacctactctgccgaatacagtgcttctggctcctcttcctacctcgctgtgtacggctgggtcaactatcctcaggctgaatactacatcgtcgaggattacggtgattacaacccttgcagctcggccacaagccttggtaccgtgtactctgatggaagcacctaccaagtctgcaccgacactcgaactaacgaaccgtccatcacgggaacaagcacgttcacgcagtacttctccgttcgagagagcacgcgcacatctggaacggtgactgttgccaaccatttcaacttctgggcgcagcatgggttcggaaatagcgacttcaattatcaggtcatggcagtggaagcatggagcggtgctggc(3)胶回收DNA片段：取适量PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用小量柱离心式胶回收试剂盒进行胶回收；(4)重组酵母表达载体的构建：将克隆得到的木聚糖酶基因片段通过EcoR I位点与表达载体PGAP Zalpha A相连接，构建表达载体PGAP Z alpha-Xyl；(5)毕赤酵母宿主的转化：重组表达载体通过电穿孔法分别转化毕赤酵母SMD1168和GS115，采用毕赤酵母电转化程序，然后分别筛选出高效表达转化子；(6)酵母转化子的摇瓶发酵培养：从平板上取少量菌接种于BMGY培养基中培养2天，再转入BMMY培养基中诱导培养两天，离心去除细胞得到含木聚糖酶的上清液，然后对发酵液进行酶活和酶学性质检测；2)采用上述构建的工程菌发酵培养生产木聚糖酶：在不同规模发酵罐中扩大培养生产木聚糖酶，培养基为每升含磷酸30ml，硫酸钙1g，硫酸钾18g，硫酸镁15g，氢氧化钾4g，甘油40g，0.0004g生物素；发酵工艺为温度30℃，pH5.0，通风量为0.5vvm，搅拌100～500转/分，使溶氧控制在20％以上；发酵分为两个阶段，第一阶段为菌体生长阶段，按5％接入种子后，种子开始在上述培养基中生长，培养时间48小时，当甘油耗尽时，溶氧会迅速上升；此时转入第二阶段，流加诱导培养基，使溶氧始终维持在20％以上，培养时间为100至200小时，微滤去除酵母细胞得到含木聚糖酶的上清液。