[发明专利]一种硝西泮人工抗原的制备方法

摘要

一种硝西泮人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明以硝西泮为原料，利用铁粉还原法使硝西泮苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；再利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备硝西泮的人工抗原即硝西泮－牛血清蛋白。本发明合成了硝西泮的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

主权项

1.一种硝西泮人工抗原的制备方法，其特征是以硝西泮为原料，利用铁粉还原法使硝西泮苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；再利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备硝西泮的人工抗原即硝西泮-牛血清蛋白；步骤为：1)人工半抗原的制备：称取9mmol还原铁粉于50ml圆底烧瓶中，加入10ml水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min；另称取硝西泮3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液中，回流反应4～6h，趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出沉淀，过滤，干燥得到2mmol半抗原1，3-二氢-7-胺基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮备用；反应终点监测：采用薄层层析法进行监测，硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μl点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸乙酯-正己烷混合溶剂，乙酸乙酯/正己烷体积比为1∶1，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.25处观察到显色点作为反应终点；2)人工抗原的制备：制备A液：称取0.1mmol半抗原于20ml烧杯中，加入10ml二甲基甲酰胺、1ml水和1ml的1N盐酸，形成深红色溶液，冷却至2℃；然后逐步滴加1M亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝停止滴加，低温下搅拌1h，此液为A液；制备B液：称取400mg的牛血清蛋白溶于15ml的pH9.0硼酸盐缓冲液，低温保存，此液为B液；在低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9；在4℃条件下搅拌保存过夜，得人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：硝西泮-牛血清蛋白。