[发明专利]利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括：选哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在框架上建立一个唯一的酶切位点，再将人AT－III蛋白基因功能部分，乳蛋白分泌序列和肠激酶蛋白质酶切序列基因，连接在表达框架上，载体的末端再连接一个筛选基因；将表达载体转入体外培养的动物体细胞中；获得含有人的AT－III蛋白基因的细胞株；转基因细胞株移入山羊成熟的去核卵母细胞内，使供核细胞和去核卵母细胞融合；克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，经妊娠获得转基因克隆羊；检测转基因动物乳汁中的人AT－III蛋白的含量和活性、提纯；经动物试验和人体试验；重组人AT－III蛋白在人体上的应用。

主权项

1.一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是该方法包括下述步骤：(1)选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在乳蛋白基因的表达框架上建立唯一的酶切位点和乳蛋白分泌序列，然后将重组人的抗凝血酶III蛋白基因和肠激酶蛋白质酶切序列连接在乳蛋白基因的表达框架上，转基因载体的末端再连接一个筛选基因；(2)所构建的载体经DNA序列分析，确定人的抗凝血酶III蛋白基因与乳蛋白基因的DNA序列，并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致；(3)用电穿孔或脂质体诱导的方法，将人的抗凝血酶III蛋白基因表达载体，转入体外培养的动物的体细胞中；(4)在培养基中对细胞株进行筛选，获得筛选后的阳性细胞株；一部分细胞冷冻保存，一部分细胞用于制备DNA；(5)阳性细胞株的DNA，经PCR和Southern杂交分析，确定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的细胞株；(6)转基因的细胞株的细胞移入山羊成熟的去核卵母细胞的卵周隙内，然后使供核细胞和去核卵母细胞融合；(7)将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，经妊娠获得转基因克隆羊；(8)检测转人的抗凝血酶III蛋白基因的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白含量；(9)含有人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白的提纯；(10)纯化的重组人的抗凝血酶III蛋白的动物试验；(11)重组人的抗凝血酶III蛋白在人体上的应用。