[发明专利]hMCP－hRANTES－pcDNA3.1重组质粒的构建与表达方法无效
| 申请号： | 200610052235.0 | 申请日： | 2006-06-30 |
| 公开（公告）号： | CN1884553A | 公开（公告）日： | 2006-12-27 |
| 发明（设计）人： | 吴南屏;陈亮;靳昌忠 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/64 | 分类号： | C12N15/64;C12N15/66;C12N15/62;C12N15/12;C12N15/85;C07K19/00;C07K14/435;C07K14/52 |
| 代理公司： | 杭州中成专利事务所有限公司 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 310003浙江省杭州市上城区*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种hMCP－hRANTES－pcDNA3.1重组质粒的构建与表达方法：(1)以正常人外周血淋巴细胞总RNA为模板合成cDNA第一链，通过聚合酶链反应扩增hRANTES基因和hMCP－1基因，产物用纯化试剂盒回收；(2)通过酶切、连接分别构建重组hRANTES－pcDNA3.1、hMCP－pcDNA3.1和hMCP－hRANTES－pcDNA3.1融合表达质粒；(3)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，抽提hRANTES－pcDNA3.1、hMCP－pcDNA3.1和hMCP－hRANTES－pcDNA3.1重组质粒DNA；(4)重组质粒共转染CHO细胞，有限稀释法筛选高效表达hRANTES、hMCP及hMCP－hRANTES的阳性细胞克隆；(5)纯化RANTES、MCP及MCP－RANTES融合蛋白。 | ||
| 搜索关键词： | hmcp hrantes pcdna3 重组 质粒 构建 表达 方法 | ||
【主权项】：
1、hMCP-hRANTES-pcDNA3.1重组质粒的构建与表达方法，其特征在于下述步骤：(1)以正常人外周血淋巴细胞的总RNA为模板合成cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，聚合酶链反应(RCR)扩增hRANTES基因和hMCP-1基因，PCR产物用纯化试剂盒回收；(2)通过酶切、连接反应分别构建重组hRANTES-pcDNA3.1、hMCP-pcDNA3.1和hMCP-hRANTES-pcDNA3.1融合表达质粒；(3)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，抽提hRANTES-pcDNA3.1、hMCP-pcDNA3.1和hMCP-hRANTES-pcDNA3.1重组质粒DNA；(4)重组质粒共转染CHO细胞，有限稀释法筛选高效表达hRANTES、hMCP及hMCP-hRANTES的阳性细胞克隆；(5)冷冻、浓缩并纯化CHO细胞培养上清液，得到RANTES、MCP及MCP-RANTES融合蛋白。
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