[发明专利]生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法

摘要

生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，该方法包括了分离肝细胞的体外灌流和肝细胞洗涤两个过程，在现有二步灌流法的基础上采用了四步灌流的方法，并设计了四步灌流的有关试剂，该发明有效提高了分离肝细胞的数量、活率和纯度，方法适用于以外科方法获取的正常猪、或狗、或成人肝移植供肝、或合法引产来源人胚胎肝脏的肝细胞分离，制备的肝细胞可广泛用于肝细胞研究、肝细胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝等。

主权项

1、生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，主要包括肝脏的体外灌流，肝细胞洗涤二个过程，其特征在于：所述肝脏的体外灌流采用下述(1)-(4)四步灌流过程：(1)在常温条件下用含EDTA的灌流液PBE按所用肝脏重量的4-5倍量灌注，采用尖细滴管经蠕动泵灌流3-5分钟，然后用预先加热至39℃的含EDTA的灌流液PBE，采用按所用肝脏重量的8-10倍量继续灌流5-10分钟；(2)用不含EDTA的灌流液PB按所用肝脏重量的5-7倍量灌注3-5分钟，然后将肝脏转移至新的无菌盆中；(3)将预热至39℃的含Dispase的灌流液PBD，按按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟后，弃去半量的含Dispase的灌流液；(4)将预热至39℃的含胶原酶和氯化钙的灌流液PBC，按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟，然后继续用灌流液PBD与PBC混合重复循环灌流5-8分钟，直至肝包膜与肝细胞分离，用手术刀片切开肝包膜、分离未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬液。