[发明专利]热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统及其用于表达胸腺素α1的方法

摘要

涉及一种基因工程,构建了包含蓝藻热休克基因groESL强启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统,并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行转基因表达胸腺素α1,由于利用热休克基因groESL的强启动子,易调控,经热诱导后能几十上百倍地加快转录,同时利用泛素融合技术,使目的基因Tα1得到高效表达,本发明工艺简单,可举一反三,具有很大的开发前景,为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。

主权项

1．热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统，其特征在于根据蓝藻Synechococcussp.PCC7942的groESL操纵子中ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2：P15′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠP23′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠP2的5′端设计了一个SphⅠ酶切位点，其切点为GCATG↓C；以蓝藻Synechococcussp.PCC7942基因组DNA为模板，以p1和p2引物进行特异性PCR扩增得含groESL启动区的PCR扩增片段；用HindⅢ酶切质粒pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组，连接物转化E.coliJM101，以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒pUCMT1’；根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计PCR引物T1、T2和T2’：T1(5′端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠBamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠSpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalⅠSpeⅠ以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2：U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段；纯化UBDNA片段和Tα1DNA片段，用BamHⅠ同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1DNA片段；用SphI同时单酶切groESL启动区的PCR扩增片段和UBTα1DNA片段，连接后以连接物为模板，P1、T2，为引物按常规PCR法扩增后得ESL-UBTα1片段，将ESL-UBTα1片段插入到质粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位点之间，连接物转化受体菌E．coliJM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，获得包含热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTα1，终止区以及Km标记基因的蓝藻的完整表达载体质粒pEUTMT1。