本申请涉及一种D‑氨基酸氧化酶突变体及其编码基因,以及利用该突变体构建的基因工程菌在酶法拆分外消旋型草铵膦生成PPO的应用。所述D‑氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D‑氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时,所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第54位,第213位,第233位,第335位和/或第341位的氨基酸残基的替换,并且所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90%的同一性。本发明构建的基因工程菌具有高产D‑氨基酸氧化酶的性质,用于催化D‑PPT的氧化反应,可在6h内达到49.5%的转化率,转化效率远高于野生型DAAO的转化效率,可用于微生物酶法拆分外消旋型草铵膦。