本发明公开了一套同时检测EHNV、VNNV和RSIV的引物和探针组合,包括:针对EHNV的两条特异性引物和一条探针,针对VNNV的两条特异性引物和一条探针,针对RSIV的两条特异性引物和一条探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~9所示,所述探针的3’端连接有荧光标记基团。所述引物和探针组合在制备检测试剂盒中的应用,在同时检测EHNV、VNNV和RSIV中的应用。本发明还公开了一种同时检测EHNV、VNNV和RSIV的检测方法。本发明根据流行性造血器官坏死病毒、鱼类病毒性神经坏死病毒和真鲷虹彩病毒的基因保守区设计特异性引物和探针,用荧光PCR技术在同一反应体系中对EHNV、VNNV和RSIV核酸进行体外扩增检测,不仅提高了检测敏感度,而且也大大提高了检测效率。