本发明公开了一种同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒,所述试剂盒包含可同时检测猴痘病毒和猴B病毒的引物混合物,检测所述猴痘病毒的引物序列如SEQ IDNo.01和SEQ ID No.02所示;检测猴痘B病毒的引物序列如SEQ ID No.03和SEQ ID No.04所示。本发明还提供了一种荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法,包括以下步骤:1)特异性PCR扩增猴痘病毒和猴痘B病毒;2)扩增结束后生成溶解曲线以利用溶解曲线Tm值的差异来区分猴痘病毒和猴B病毒。本发明具有可快速、准确地同时对猴痘病毒和猴B病毒进行检测等特点。