本发明公开了一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物及其应用,属于分子遗传学领域,该分子标记引物包含核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑14所示的7对引物对。本发明利用SLAF‑seq技术对顶芒山羊草、中国春及普通小麦‑顶芒山羊草5M单体附加系进行测序,通过序列比对分析获得了5M染色体的特异序列,以此为基础,设计出了顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记引物共7对。这些标记可用来检测小麦背景中的5M染色体,快速筛选具有5M染色体的植株,进而方便进行具有顶芒山羊草血缘或优异性状小麦的分子辅助育种,提高小麦背景中顶芒山羊草5M染色体外源遗传物质的检测效率。