本发明公开了一种用于鉴别鸡新型环状病毒与鸡传染性贫血病毒的特异性引物,包括用于检测鸡新型环状病毒的检测引物GyV3‑1/GyV3‑2,和用于检测鸡传染性贫血病毒的检测引物CIAV‑5/CIAV‑6;其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示。一种鸡新型环状病毒与鸡传染性贫血病毒鉴别诊断试剂盒,包括上述用特异性引物,以及阳性质粒。一种鉴别鸡新型环状病毒与鸡传染性贫血病毒的方法:提取待测样品的基因组DNA,利用特异性引物进行扩增,对扩增产物进行电泳并观察有无扩增条带,从而作出判断。本发明对两种病毒DNA的最低检出量均低于100拷贝,且对其他常见鸡源病毒均检不出,具有敏感性高、特异性好等优点。