本发明提供热稳定胆固醇酯酶突变体OPE‑D136P及其制备方法，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用FoldX等软件，结合热稳定胆固醇酯酶突变体自由能的变化值，构建突变体电子文库；利用多种生物信息学软件分析淘汰结构不合理的突变体；从结构合理的突变体中，筛选具有脯氨酸效应的突变体，进一步分析：突变氨基酸残基的相对溶剂表面积（大于50%）和突变位点氨基酸残基在370K和300K下的RMSF值的差值（大于零）。利用上述方法构建筛选热稳定性胆固醇酯酶突变体，阳性突变体频率高达66.7%，有效降低筛选工作量；获得的突变体OPE‑D136P的失活半衰期较野生型OPE延长3.6倍。
本发明提供热稳定胆固醇酯酶突变体OPE‑S109P/S271P及其制备方法，所述突变体序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用软件，结合突变体自由能的变化值，构建突变体电子文库；从结构合理的突变体中，筛选出突变位点位于β‑转角的突变体，进行分析：组成β‑转角氨基酸残基z_B‑factor的平均值大于零；组成β‑转角氨基酸残基z_RMSF的平均值大于零；突变位点所的β‑转角柔性值大于1；与热稳定蛋白β‑转角氨基酸偏好性相同。满足上述两个条件的突变体组成微型突变文库。利用上述方法构建所述突变体，阳性突变体频率为33.3%，有效降低筛选工作量；获得突变体的失活半衰期较野生型OPE延长了3.6倍。
本发明提供了耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法，脂肪酶突变体多肽链的氨基酸序列及其基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还包含了所含的脂肪酶突变基因的重组质粒及转化子。本发明利用ESI‑Q‑TOF‑MS分析脂肪酶经过氧化氢处理前后分子量的变化，确定被氧化氨基酸残基类型；进而利用丙氨酸扫描法确定被氧化氨基酸残基的位置；最后，利用定点突变技术和叠加突变技术，构建并筛选出对过氧化氢有良好耐受能力的脂肪酶突变体。利用本方法构建、筛选的脂肪酶突变体，阳性突变率为75%；其中LipA‑Trp42Ala/Met134Glu耐受过氧化氢的C50提高了10倍。
