本发明公开了一种可鉴别检测羊巴贝斯虫未定种及莫氏巴贝斯虫的试剂和方法。本发明的试剂包括有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的五条人工序列。本发明首次使用套式PCR,多重PCR进行组合,将两种PCR的优点集中于一个方法,且通过技术优化,克服了两种方法的缺点,将反应体系于PCR仪中一步法两个反应过程完成。本发明克服了传统的病原学检测方法难于区分巴贝斯虫种类和敏感性低、操作繁琐、检测成本高等缺点,具有检测速度快、有较高的特异性、灵敏度和可重复性,使用步骤简单的优点,适合于生产实践中临床动物或传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的鉴别检测和大规模的分子流行病学调查。