本发明适用于分子生物学及微生物检测技术领域,提供一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒及检测和分型方法,该检测试剂盒包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶,还包括stp、sth、lt、aggR、eaeA、escV、stx1、stx2、ipaH基因的引物及探针SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:27,还包括序列为SEQ ID NO:28的Homo-tag。该检测和分型方法包括以下步骤:获得并处理样品,加入至检测试剂盒中;进行荧光定量PCR反应;获得检测结果。本发明的检测和分型方法特异性好,灵敏度高,操作简便,结果易于判读,适用于对致泻性大肠杆菌的快速筛查和分型。