本发明公开了一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片,包括载体,以及位于载体上的寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照及空白的点涂层;所述杂交过程阳性对照为Biotin;所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针,其序列如SEQ ID NO.2、3、8~33所示;或所述寡核苷酸探针包括35条真菌探针,其序列如SEQ ID NO.1~35所示。本发明的基因芯片可用于检测杨树溃疡病病原真菌,涵盖5属16种。本发明所建立的多重PCR扩增环境样本的芯片通量检测诊断杨树溃疡病技术在北京地区的杨树溃疡病的检测中得到初步应用。本发明能为建立其它有害生物的高通量检测技术、及相关生物多样性为基础的应用和研究服务。