本发明提供了一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用,属于基因工程技术领域,所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述的融合基因BFNA的制备方法,包括以下步骤:1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增,获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段;2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因。本发明中,所述重组腺病毒包括所述融合基因,对于肿瘤具有显著的抑制作用,能够延长成瘤时间,抑瘤率达到82%以上。