本发明公开了一种索托帕拉雅病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒,该试剂盒包含对索托帕拉雅病毒S基因的一段区域进行特异性检测所用的引物对和探针,所述引物对和探针的序列如下SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示,所述探针5'端连接荧光基团,3'端连接淬灭基团。本发明还提供的对鼩鼱科样本中索托帕拉雅病毒的实时荧光RT‑PCR检测检测方法,该方法实现鼩鼱科动物中索托帕拉雅病毒快速检测,提高了较低病毒载量下阳性标本的检出率,解决了假阴性标本的判断难的问题,并很好的改善了引物简并性及灵敏度的问题、提高了病原体的检出率,同时将污染风险减到最低,非常适合大规模病原体筛查。