本发明提供了一种肝癌筛查试剂盒及其使用方法与应用,所述试剂盒包括能够检测ACADS基因甲基化水平的引物和探针:核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的荧光探针;所述试剂盒还包括内参基因ACTB的引物和探针;本发明还提供了该试剂盒的使用方法,通过对粪便核酸样本进行提取、甲基化转化和使用上述引物和探针进行PCR扩增即可得到检测结果。该试剂盒对于肝癌诊断的灵敏度高、特异性强,能够有效提升肝癌的检出率;且其使用时无创、安全和方便,能够提升受检者的接受程度,有利于扩大肝癌筛查的推广。