本发明公开了一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法。该方法包括:将yEmRFP(SEQ ID No.1)分成N端(第1‑159位)和C端(第160‑236位);在N端编码基因5’或3’端通过连接序列(编码SEQ ID No.2所示连接肽)连接目的蛋白A的编码基因,形成融合基因片段A;在C端编码基因5’或3’端通过所述连接序列连接目的蛋白B的编码基因,形成融合基因片段B;将融合基因片段A和B导入受体酵母细胞,培养所得转基因酵母细胞,检测其是否产生红色荧光,若产生红色荧光,则目的蛋白A与B互作;若不产生红色荧光,则目的蛋白A与B不互作。本发明建立的BiFC技术具有较高的敏感性和特异性,适合于在酵母中开展蛋白质相互作用筛选。