本发明公开了一种同步检测多种眼内感染病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒和方法。该试剂盒中含有用于检测人类疱疹病毒6型的引物对和探针及用于检测风疹病毒的引物对和探针,用于检测人类疱疹病毒6型的引物对和探针分别具有如SEQ ID No.1‑3所示的核苷酸序列,用于检测风疹病毒的引物对和探针分别具有如SEQ ID No.4‑6所示的核苷酸序列。本发明使用多重实时荧光定量PCR技术对HHV‑6和RV进行同时检测,操作简便;引物对和探针不仅特异性强、准确性高,而且对各自对应的病毒检测灵敏度高,HHV‑6和RV的最低检出限均为500copies/mL。