本发明公开了与甜瓜蔓枯病抗性基因Gsb‑3共分离的InDel分子标记及其应用。通过构建重组自交系分离群体,利用BSA方法结合全基因组重测序对甜瓜蔓枯病抗性进行基因定位,在两亲本之间具有多态性的位点设计开发InDel分子标记,并在分离群体各株系中对分子标记进行筛选验证,最终挖掘到了一个与甜瓜蔓枯病抗性基因Gsb‑3共分离的分子标记。该分子标记所包含的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物经PCR扩增得到,扩增得到的片段分别与抗病和感病基因共分离。本发明提供的分子标记可以有效、快速的区分甜瓜蔓枯病抗、感单株,提高了甜瓜蔓枯病表型鉴定的准确性,可作为一种有效的手段应用于甜瓜蔓枯病抗病育种实践中。