本发明涉及一种重组蝮蛇蛇毒蛋白的制备方法。利用人工合成的美国铜斑蝮蛇(Agkistrodon contortrix)突变蛇毒纤溶酶Alfimeprase基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将其连接到酵母表达质粒pPIC9K中构建高效表达载体pPIC9K-His-Alf,导入毕赤酵母株GS115,命名为FY-Alf。甲醇诱导表达,表达的重组蛋白经纯化后,用平板溶圈法验证其活性,结果表明含pPIC9K-His-Alf质粒的酵母菌株GS115表达的重组蛋白Alfimeprase具有较高纤溶活性。