本发明属于基因工程和生物催化领域,具体公开了一种耐热α‑L‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用;所述α‑L‑鼠李糖苷酶为如(a)或(b)所述的蛋白质:(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有α‑L‑鼠李糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明提供了一种新型热稳定性较强且能高效切除芦丁α‑1,6鼠李糖苷键的α‑L‑鼠李糖苷酶,能够长时间耐受高温,热稳定性优异,对芦丁有较高的水解效率,摩尔转化率高达99.5%,并且公开了上述酶转化芦丁为异槲皮素的最佳反应条件。