[发明专利]一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法

说明书

本申请公开了一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法，主要包括如下步骤：构建含有ELP标签的载体蛋白和目的蛋白；使用修饰载体蛋白制备复性工具分子；复性工具分子和变性目的蛋白通过ELP标签在高于相变温度时形成复性复合物；完成复性的复合物，通过降低温度至相变温度之下诱发相变反应使聚合的ELP标签解聚，释放出复性完全的目的蛋白，复性工具分子回收再利用；含有ELP标签的复性完全的抗原免疫动物，由于机体温度高于相变温度，抗原于体内诱发自聚集，进而增加抗原表位，提高抗原稳定性，大幅提升低分子量蛋白的免疫效率。本发明解决了PEG修饰后蛋白免疫原性下降从而不能用于免疫及低分子量蛋白免疫原性低，体内易降解的问题。

技术领域

本申请涉及蛋白体外复性领域，尤其涉及一种可提高低分子量蛋白体外复性效率和增加其免疫原性的方法。

背景技术

通过免疫实验动物制备抗体是一项成熟的生物技术，产生的特异性抗体作为工具被广泛的应用于生命科学研究、临床诊断以及检验检疫等领域。根据应用要求的不同对抗体的性能也存在着不同的要求。

临床检测中通常会通过免疫反应来检测体液中某靶标物质含量的多少进行病情的诊断和治疗效果的判定。由于某些情况下（如尿液）靶标物质含量极低，这就要求相关抗体拥有极高的效价和灵敏度，对痕量靶标也可以做到精准的识别。

众所周知，抗体的性能决定于抗原的质量。纯度越高，结构越接近天然蛋白的抗原越能取的高性能的抗体。通常来说，免疫用抗原优先选择天然来源，但受制于材料来源有限以及杂蛋白过多的影响无法满足持续生产的要求。

第二条思路是利用基因工程技术，将目标蛋白基因重组表达于原核、真核以及哺乳动物细胞等表达体系中，通过大规模发酵和培养后纯化得到目的蛋白。但很多人源蛋白质无法表达或无法正确表达，针对这一情况通常的做法是根据蛋白结构和组成的分析对部分“关键区域”进行截短表达，以增加目的蛋白的表达几率，而对于表达不正确的蛋白如包涵体表达等则需要进行体外复性，通过变性后的蛋白在适宜条件下重折叠来形成正确的结构。

以常用的原核表达系统为例，由于大肠杆菌等原核生物的蛋白转录及转译系统非常原始，其对于人源蛋白的表达相对困难，且对重组蛋白大小有着较为严格的限制，通常大于30kd的蛋白成功表达的几率很低。所以更倾向于重组表达目标分子的特异表位(一般10~30kd）作为抗原进行免疫。

而低分子量蛋白抗原进行免疫经常面临2个问题：1低分子量蛋白免疫原性较低，不易取得高效价抗体；2 蛋白结构不正确，产生的抗体同天然蛋白产生的抗体性质差异过大。

解决免疫原性低常见的思路是通过体外修饰（许杨等 CN200910115824.2）和人工纳米微球组装（刘琦等 2016）等提高抗原的免疫原性和体内稳定性，以获得高效价抗体。解决结构不正确的问题则是通过体外复性工艺的优化以获得结构正确的抗原分子（洪文艳等2017）。综上所述，低分子量蛋白作为抗原进行免疫是获得抗体的有效手段，而获取高性能抗体的关键在于抗原结构正确以及延长其在体内的稳定性。抗原结构的正确往往依赖于蛋白复性工艺的开发，其大致思路都是优化变性蛋白重折叠的过程，保持复性分子的独立性，避免因分子碰撞造成的错误聚集和折叠。做为常见的复性辅助分子，聚乙二醇及其衍生物经常被应用于蛋白质的体外复性工艺中。

聚乙二醇是一种高分子聚合物，化学式是HO(CH₂CH₂O)_nH；分子量从几千到几万不等。化学性质稳定，是常见的医用辅料，Schaffer 等1950年对PEG的生物安全性研究表明，当分子量大于1000时，无明显的生物毒性。在生物制药领域不同改性的聚乙二醇分子如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)等被开发出来用于修饰不同的药物分子，以达到增加体内稳定性和降低免疫原性的作用。

聚乙二醇及其衍生物具有高度亲水性，在水溶液中具有较大的水化半径，当偶联到目标分子（蛋白质、药物分子等）表面时可以改变其在水溶液中的生物分配和溶解性，在其修饰的分子周围形成空间屏障，减少其他大分子如酶类的靠近以增加该分子在溶液中的稳定性。