[发明专利]应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法。本发明公开了染色体端粒DNA的扩增方法，包括下列步骤：1)提取基因组DNA；2)将步骤1)的基因组DNA进行预处理；3)将步骤2)获得的预处理后的基因组DNA两端的末端添加扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA；4)分别对步骤3)的带有扩增接头的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增。本发明公开的检测染色体端粒DNA全长的方法能达到单碱基分辨率，弥补了特异性地准确测量单条染色体完整端粒DNA技术的空白。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法。

背景技术

端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，其作用是保护染色体DNA的末端，避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等。在哺乳动物细胞中，端粒DNA由TTAGGG序列和AATCCC序列重复串联组成。由于DNA的末端复制问题，细胞的每次分裂都伴随着端粒DNA一小段序列的丢失。细胞的每次分裂都会伴随着染色体末端端粒的缩短，细胞也因此逐渐老化、直至丧失增殖能力而死亡。端粒长度的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此测量端粒长度能提供与疾病相关的重要信息。

目前测量端粒长度主要是基于qPCR的方法，对重复区段进行扩增，端粒DNA的片段越长，重复区段的拷贝数就多。但是这种方法只能检测所有染色体端粒重复区段长度的大概平均值，无法精确检测单独每一条染色体的端粒长度。而且由于染色体DNA其他部分也存在类似端粒DNA重复序列的结构，这部分序列也会影响qPCR对端粒长度的检测。从实验操作上来说，由于qPCR反应很容易受到其他条件影响，基于qPCR测量方法的定量结果稳定性不好，如果结果Ct值相差1，会导致端粒长度测量结果增加1倍。

因此，研发新的、更准确的测量端粒DNA长度的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，能有效解决当前不能获得端粒DNA全长和准确测量单条染色体端粒DNA的技术缺陷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明公开了染色体端粒DNA的扩增方法，包括下列步骤：

1)提取基因组DNA；

2)将步骤1)的基因组DNA进行预处理；

3)将步骤2)获得的预处理后的基因组DNA两端的末端连接扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA；

4)分别对步骤3)的带有扩增接头的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增。

作为优选，所述步骤2)的基因组DNA进行预处理为将所述基因组DNA的两端进行末端修复。

作为优选，所述步骤2)基因组DNA两端进行末端修复为将基因组DNA片段的末端补平，然后对基因组DNA的5’端进行磷酸化，以及将基因组DNA片段的3’端添加腺嘌呤dA。

更为优选，所述腺嘌呤dA为脱氧腺嘌呤dA。

作为优选，所述步骤3)的扩增接头还包括标签序列。

其中，所述步骤3)的扩增接头还包括标签序列，具体为所述扩增接头与所述标签序列重组后的新型扩增接头。所述新型扩增接头除了扩增接头外还包括标签序列。

其中，所述扩增接头直接与步骤2)的预处理后的基因组DNA连接，或所述扩增接头与所述标签序列重组后的新型扩增接头与步骤2)的预处理后的基因组DNA连接。

其中，所述步骤4)扩增得到的端粒DNA产物的序列包括端粒DNA序列和标签序列。