[发明专利]基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法有效
| 申请号： | 201710124534.9 | 申请日： | 2017-03-03 |
| 公开（公告）号： | CN106939313B | 公开（公告）日： | 2020-01-10 |
| 发明（设计）人： | 王福生;赵晓春;申晚霞;刘小丰;朱世平 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院柑桔研究所 |
| 主分类号： | C12N15/29 | 分类号： | C12N15/29;C12N15/11;C12N15/83;C12N15/66;A01H5/00;C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 50211 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) | 代理人： | 邹晓艳 |
| 地址： | 400712 重*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 沉默 指示 及其 病毒 诱导 载体 以及 构建 侵染 方法 | ||
【说明书】：
本发明公开了一种用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如SEQ ID No:1所示，还公开了含有该序列的病毒诱导沉默载体及其构建方法，并利用该沉默载体侵染柑橘幼苗的方法。本发明为TRV介导的病毒诱导基因沉默体系提供有效的指示基因，是首次在柑橘中成功建立TRV介导的病毒沉默系统，成功地沉默了柑橘中的指示基因。利用本发明的沉默载体构建的沉默系统操作简单、转化效率高、能够快速地在柑橘中对基因进行功能验证。能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，表型显著。本发明提供的沉默载体为快速、有效地在柑橘中进行基因功能验证提供了可靠技术。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法。
背景技术
柑橘属于多年生木本植物，通过常规的遗传转化技术验证基因功能，一直受到遗传转化率低、再生周期长和童期长等困扰。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)是一个抑制内源基因表达的强大工具，因其具有快速、高效、高通量、便利、便宜等优点，已被用于如马铃薯(Solanum tuberosum)、本生烟(Nicotianabenthamiana)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、西红柿、水稻(Oryza sativa)和玉米(Zeamays)等多种植物的基因功能研究。目前，多个VIGS载体被应用于解析代谢途径、植物发育、生物和非生物胁迫。近年来，多种VIGS载体相继得到开发并在多种植物中得到广泛的应用。其中，烟草脆裂病毒(TRV)是目前应用最广泛的VIGS载体，它是由TRV1与TRV2两条RNA病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV作为病毒载体有诸多优点，比如病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等，因而被广泛应用。虽然，来源于柑橘的叶疱斑病毒(citrus leaf blotch virus，CLBV)和衰退病病毒(citrustristeza virus，CTV)的载体已在柑橘中建立沉默体系，但存在基因沉默表型出现慢、不是很稳定，未被应用于更广泛的基因功能研究。TRV是很多草本和少数木本植物中广泛应用于鉴定基因功能的VIGS载体。在这些寄主植物中，TRV引起的症状比其它载体相对温和，并且能够快速地传递到分生组织、根、果实、花和叶等整个植株，甚至通过种子传到子代。然而，TRV载体是否能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，目前尚未见报道。
Magnesium chelatase subunitI(CHll)基因是控制叶绿素的生物合成相关的基因，在一些植物中被作为一个通用的VIGS报告基因，沉默此基因导致叶片形成黄化现象。目前柑橘的CHll基因目前还未得到证实和报道。
发明内容
针对以上问题，本发明一方面提供一种用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
本发明另一方面提供了一种含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体，所述载体为TRV介导的柑橘CHll基因病毒诱导沉默载体，其含有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
本发明另一方面还提供了一种上述含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)提取柑橘植株cDNA；
(2)以柑橘植株cDNA为模板，以引物CiCHll-V2-F和CiCHll-V2-R进行PCR扩增，引物序列为：
CiCHll-V2-F：5’-TCTAGAGGTCTGTGGGACGATTGACAT-3’，
CiCHll-V2-R：5’-GAGCTCCGAGCTCTCTCCTCCACAATC-3’；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行回收纯化得到目的基因片段；
(4)用XbaI和SacI限制性内切酶分别对TRV2载体和步骤(3)得到的目的基因片段进行双酶切；
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- 2017-03-03 - 2020-01-10 - C12N15/29
- 本发明公开了一种用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如SEQ ID No:1所示，还公开了含有该序列的病毒诱导沉默载体及其构建方法，并利用该沉默载体侵染柑橘幼苗的方法。本发明为TRV介导的病毒诱导基因沉默体系提供有效的指示基因，是首次在柑橘中成功建立TRV介导的病毒沉默系统，成功地沉默了柑橘中的指示基因。利用本发明的沉默载体构建的沉默系统操作简单、转化效率高、能够快速地在柑橘中对基因进行功能验证。能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，表型显著。本发明提供的沉默载体为快速、有效地在柑橘中进行基因功能验证提供了可靠技术。
- 拟南芥U1A基因在提高植物耐盐性中的应用-201711099442.6
- 郑军;王振宇 - 中国农业科学院作物科学研究所
- 2017-11-09 - 2020-01-10 - C12N15/29
- 本发明提供了拟南芥U1A基因在提高植物耐盐性中的应用。所述拟南芥耐盐基因U1A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次证明拟南芥U1A基因参与了植物抵抗盐胁迫的生物学过程，将拟南芥U1A基因应用于培育耐盐植物，以及作为耐盐育种技术领域具有良好的应用前景。
- 大豆GmHsps_p23-like基因及其应用-201911049273.4
- 刘思言;李广隆;鲁中爽;关淑艳;曲静;姚丹;王蕊;刘金凤;刘明明;李远强;幺梦凡;张桐禹;任萍;边文娟;卢昆鹏;胡绍旺 - 吉林农业大学
- 2019-10-31 - 2020-01-07 - C12N15/29
- 本发明提供一种大豆GmHsps_p23‑like基因及其应用，属于植物基因工程领域。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明利用RT‑PCR技术克隆大豆GmHsps_p23‑like基因，成功重组了含有草铵膦筛选标记的该基因植物表达载体：pCAMBIA3301‑GmHsps_p23‑like和CRISPR/Cas9‑GmHsps_p23‑like。通过农杆菌介导大豆子叶节法，将两套植物表达载体对大豆进行遗传转化。干旱胁迫鉴定结果表明，本发明的GmHsps_p23‑like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。
- 一种烟草反转录转座子基因Ntrt1及其用途-201510859299.0
- 郭玉双;任学良;余婧 - 贵州省烟草科学研究院
- 2015-12-01 - 2020-01-07 - C12N15/29
- 本发明公开了一种烟草反转录转座子基因Ntrt1，其特征在于：具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其编码的蛋白质，其特征在于：具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；用于调节烟草植株的高矮。
- 一种白桦抗旱基因BpbZIP36及其表达载体、蛋白和应用-201810631010.3
- 王艳敏;王玉成;杨传平;王超;梁福生;张一鸣 - 东北林业大学
- 2018-06-19 - 2020-01-07 - C12N15/29
- 本发明涉及基因领域，提供一种白桦抗旱基因BpbZIP36，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。试验表明，将本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36构建为表达载体pROK2‑BpbZIP36后转入到白桦苗中得到转基因白桦，白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因白桦中过量表达。在非生物胁迫条件下，转基因白桦与野生白桦的生长状况无显著差异；干旱条件下胁迫7d后，转基因白桦的长势明显优于野生白桦，表明本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36具有显著的抗旱作用，能够用于培育获得抗旱性能优异的转基因林木。
- 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用-201710050196.9
- 蔡新忠;徐幼平;郭伟毅;程维舜 - 浙江大学
- 2017-01-23 - 2020-01-07 - C12N15/29
- 本发明提供一个水稻抗病调控基因，命名为OsASR2。该基因的开放阅读框长549bp，编码一种ASR蛋白，由182个氨基酸组成。该基因编码蛋白包含ABA/WDS结构域。本发明通过构建OsASR2基因表达受到抑制的RNAi水稻，首次阐明了该基因对水稻细菌性条斑病抗性的调控作用。OsASR2‑RNAi植株表现出强烈的水稻细菌性条斑病抗性，从而揭示了OsASR2基因对水稻细菌性条斑病抗性的强烈负调控功能。本发明同时提供了OsASR2基因通过创制其RNAi水稻来获取强烈抗细菌性条斑病水稻新材料的应用。本发明提供的OsASR2基因是一种适用于创制和选育高抗细菌性条斑病的水稻新材料和新品种的新基因资源。
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