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公布日期
2020-09-11 公布专利
2020-09-08 公布专利
2020-09-04 公布专利
2020-09-01 公布专利
2020-08-28 公布专利
2020-08-25 公布专利
2020-08-21 公布专利
2020-08-18 公布专利
2020-08-14 公布专利
2020-08-11 公布专利
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[发明专利]一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其应用在审

技术领域

发明涉及一种重要作物病毒的全长cDNA侵染性克隆构建方法及其应用领域,尤其是一 种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其应用。

背景技术

土传禾谷类作物病毒病在世界类广泛发生且一直难以防控。在上世纪末,本实验室在我 国山东首次发现了一种引起小麦花叶病的土传病毒,分子鉴定显示该土传病毒是植物病毒的 一个新种,命名为中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvirus,CWMV)。该病毒新种现 已划入帚状病毒科(familyVirgaviridae)菌传杆状病毒属(genusFurovirus)。CWMV可 由根部专性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)传播且可在真菌介体的休眠孢子中存活 数载,因此,化学药剂也难以将CWMV从土壤中根除。CWMV在小麦病株上引起典型的症状包 括:幼叶呈现褪绿条纹,老叶则黄化甚至变成紫色。严重的病株矮缩、萎蔫甚至死亡,从而 导致产量损失严重。

CWMV粒子呈棒状,内含2条单链正义RNA(ssRNA)基因组片段,即RNA1和RNA2。本实 验室的基因组测序分析表明RNA1长7147nt,编码3个病毒运动和复制所必需的蛋白;而RNA2 则较短,仅3564nt,编码4个蛋白,其中3个与病毒外壳蛋白有关,另一个则是富含半胱氨 酸的RNA沉默抑制子。病毒全长cDNA克隆是为深入理解病毒生物学特性的重要技术手段,CWMV 侵染性克隆的缺乏不仅严重阻碍了人们对CWMV侵染、复制、组装、致病机制的理解,而且也 限制了实验室小麦抗性的鉴定。自从本实验室测定了CWMV的基因组全序列后,一直尝试构建 其全长cDNA侵染性克隆,但均未成功。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点,提供一种简单快速的构建中国小麦花叶病毒侵染性 克隆的方法及其应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案:一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法, 具体包括以下步骤:

1)引物设计:基于本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设 计4条引物,引物序列见表1,其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1,引物对P2F/P2R用于扩 增RNA2;

2)病毒基因组总RNA提取:取含50-100μlCWMV粒子的提取液,利用Trizol试剂 (Invitrogen)按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA;

3)扩增反应:以提取的病毒基因组RNA作逆转录模板,采用高保真的DNA聚合酶(NEB)进行扩增,其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2-kb,引物对P2F/P2R扩增的RNA2产物长约3.6-kb;

4)病毒cDNA克隆:扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶 切反应,酶切产物经纯化后,分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上,转化大肠杆菌,测序 验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒pT7-R1、pT7-R2;

一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法的应用,具体步骤包括:

1)体外转录:重组质粒pT7-R1、pT7-R2分别经限制性内切酶SpeI单酶切,获得线性化 的重组质粒载体并用于体外转录,体外转录反应采用AmbionmMessagemMachine试剂盒 (Invitrogen)参照产品说明书步骤进行;

2)摩擦接种:然后取RNA1和RNA2体外转录各5μg混合,溶解于1ml含50mM甘氨 酸(glycine)、50Mm磷酸氢二钾(K2HPO4)、pH9.2的缓冲液,然后取少许石英砂摩擦接种植 物;

3)侵染活性分析:二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化。

表1用于构建克隆的引物

引物名称 引物序列(5'----3’) P1FaCGGGACTTTAATACGACTCACTATAGTATTTCTTTCTCTCTACGTCGTTAG P1RbACGAGCTCACGCGTTGGGCCGGATAACCCTCCG P2FcCCCAAGCTTTAATACGACTCACTATAGTATTTCAATCTGTACAAGTGCGGTG P2RdGGAATTCACGCGTTGGGCCGGTTTACCCACC

发明有益的效果是:本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点,发展建立了一 种简单快速构建其全长cDNA克隆的方法,并成功获得了具有侵染活性的全长cDNA克隆,这 不仅有助于相关病毒的基因功能、反向遗传学的研究,而且有利于小麦抗性的筛选等。

附图说明

图1:CWMV全长cDNA克隆体外转录物侵染性活性分析,其中叶片1来自于摩擦接种CWMV 全长cDNA克隆体外转录物的小麦植株;叶片2来自于接种野生型CWMV的小麦植株;叶 片3来自于模拟接种(mock-inoculate)的小麦植株;

图2:Northernblotting分析CWMV全长cDNA克隆体外转录物在小麦体内的复制活性,其 中样品1为模拟接种(mock-inoculate)的健康小麦;样品2为接种野生型CWMV的病株小 麦;样品3为摩擦接种CWMV全长cDNA克隆体外转录物的小麦植株;

图3:应用电子显微镜观察分析CWMV全长cDNA克隆体外转录物在小麦体内形成的病毒粒 子,其中比例尺表示50nm。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明:

实施例:一种简单快速的构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其对小麦的侵染活 性分析,具体步骤:

引物设计:通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计 4条引物,引物序列见表1,其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1,引物对P2F/P2R用于扩增 RNA2;

病毒基因组总RNA提取:取含50-100μlCWMV粒子的提取液,利用Trizol试剂 (Invitrogen)按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA,即将病毒提取液转入1.5ml新离心管, 加入1mlTrizol试剂(Invitrogen),振荡混匀后加入0.2ml氯仿,混匀后静置3-5min, 12000g离心10min,取上清至新离心管并加入等体积异丙醇,混匀后12000g、4℃条件下离 心10min,弃上清,沉淀用70%乙醇洗2次,干燥后将沉淀溶解于无RNase的ddH2O中,提取 的病毒基因组RNA经琼脂糖凝胶电泳检测合格后保存于-80℃备用;

扩增反应:以提取的病毒基因组RNA作逆转录模板,采用高保真的DNA聚合酶(NEB)进行扩增,其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2-kb,引物对P2F/P2R扩增的RNA2产物长约3.6-kb,CWMVRNA1和RNA2的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化后保存备用;

病毒cDNA克隆:扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶切 反应,酶切产物经纯化后,分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上,转化大肠杆菌,测序验 证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒pT7-R1、pT7-R2;

申请号: 201610002962.X 申请日: 2016-01-04
公开/公告号: CN105543271A 公开/公告日: 2016-05-04
申请/专利权人: 浙江省农业科学院
发明/设计人: 张恒木;羊健;张芬;李静;陈剑平
主分类号: C12N15/82
分类号: C12N15/82;C12N15/66
搜索关键词: 一种 构建 中国 小麦 花叶 病毒 侵染 克隆 方法 及其 应用
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