[发明专利]一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法在审

专利信息
申请号: 201510467499.1 申请日: 2015-08-03
公开(公告)号: CN105063078A 公开(公告)日: 2015-11-18
发明(设计)人: 周礼芹;蒙健宗;徐月梅;成春燕 申请(专利权)人: 南宁市新科健生物技术有限责任公司
主分类号: C12N15/75 分类号: C12N15/75
代理公司: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 王素娥
地址: 530003 广西壮族自治区*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 一种 利用 tn7 元件 整合 表达 蛋白 重组 枯草 芽孢 杆菌 构建 方法
【说明书】:

技术领域

本发明涉及生物技术领域,具体是一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法。

背景技术

在食品和药品用活性蛋白质的生产中,采用基因工程技术对活性蛋白质基因进行异源表达已经被证明是提高产量和纯度的有效方法。作为常用的基因工程宿主菌,大肠杆菌生长繁殖迅速,培养简单,发酵成本较低,也没有复杂的蛋白酶系,重组蛋白较稳定,因而成为生产重组蛋白质的良好宿主。但大肠杆菌用于生产食品工业用酶仍存在一些缺陷,主要有:1.大肠杆菌不是公认为安全的菌株;2.在重组大肠杆菌的高密度发酵中,表达质粒往往由于结构不稳定性和分离不稳定性而易于丢失。为了保持重组大肠杆菌表达质粒的遗传稳定性,往往需要施加选择压力,目前最常用的选择压力是添加抗生素。添加抗生素选择压力无疑会增加菌体的代谢负荷,增加生产成本,引起终产品中抗生素残留,引起抗性基因在环境中的扩散。对于食品和药物用重组蛋白质,产品中残留抗生素已逐渐被世界各国禁止。

公认为安全的微生物主要有真菌中的曲霉菌和酵母菌、细菌中的乳酸菌和枯草芽孢杆菌等,其中天然枯草芽孢杆菌在食品工业中已有悠久的应用历史,人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌;重组枯草芽孢杆菌生长速度较真菌快得多,能将酶蛋白分泌到细胞外,无需细胞破碎,分离纯化工艺简便,并且表达产物可溶,可正确折叠,并具有生物活性;因此采用枯草芽孢杆菌整合表达食品用活性蛋白质基因是较好的选择。整合的外源基因随枯草芽孢杆菌染色体DNA的复制而复制,在大多数情况下相当稳定,重组菌在不使用抗生素选择压力下可以连续传代培养而不丢失基因表达盒,可从源头上解决抗生素问题,这对生产食品用活性蛋白质产品十分有意义。

将外源基因整合到染色体上可采用同源重组和转座重组的方法,传统的RecA和λRed同源重组系统重组发生的频率较低,操作繁琐,但也可构建单拷贝的整合表达枯草芽孢杆菌和更多拷贝的整合表达枯草芽孢杆菌(李晓明等,一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产a-乙酰乳酸脱羧酶的方法,专利号ZL201010271749.1;李晓明等,一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法,专利号ZL201010563646.2;廖东庆等,将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法,专利号ZL201010563647.7)。同源重组整合存在的缺点是仍然需要在所整合的DNA片段中保留抗生素基因,以便筛选出同源交换产生的重组子。而与同源重组法相比,转座重组不需要将抗生素抗性基因整合到枯草芽孢杆菌染色体,并且可以将含有抗性基因和转座酶的整合质粒驱除出宿主菌,得到遗传稳定的外源基因整合表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法,以解决同源重组整合仍然需要在整合片段中保留抗生素基因的问题。

本发明达到上述目的的技术方案如下:

1.一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法是通过构建一种用于在枯草芽孢杆菌的转座整合质粒,插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌,通过诱导产生Tn7转座酶TnsABCD,将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点;然后通过变温培养,将培养温度从26~30℃提高到33~37℃,使转整合表达质粒上的温度敏感复制子失去作用,得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的转座整合质粒的重组枯草芽孢杆菌。将菌落转到不含抗生素的液体营养培养基上培养,能表达出活性蛋白质的菌株即为所需的转座整合表达外源蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌。

上述的营养培养基是常规的发酵营养培养基,包括蛋白胨或水解蛋白1~50g/L,酵母提取物1~25g/L,氯化钠1~15g/L。

2.利用Tn7转座元件将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌,该方法的步骤为:构建一种用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒,插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌,通过诱导产生Tn7转座酶TnsABCD,将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点。

上述用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒,包含有下列组分:能在大肠杆菌中复制质粒的复制子和能在枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子,含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点、Tn7转座酶TnsABCD片段及其诱导表达元件。

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  • 2016-10-20 - 2019-04-26 - C12N15/75
  • 发明公开了一种利用短芽胞杆菌(Bacillus brevis,B.brevis)制备脑钠肽前体抗原表位的方法。该方法将能与脑钠肽前体抗体结合的脑钠肽前体N端线性抗原表位(NT‑BNP12‑21)核苷酸序列置换人纤维连接蛋白(fibronectin 3,Fn3)编码FG区的核苷酸序列,构成Fn3与NT‑BNP12‑21线性表位融合基因,插入到穿梭质粒pNCMO2的P2信号肽下游,构建pNCMO2‑Fn3‑NT‑BNP12‑21重组质粒,使得该重组质粒在B.brevis中能高效表达分泌型的骨架蛋白Fn3融合NT‑BNP12‑21线性表位的融合蛋白。本发明可以简单、快速、高效、低成本地制备分泌型的具有和脑钠肽前体抗原性相当的融合蛋白。
  • 一种高效穿梭表达载体及其构建方法与应用-201510199070.9
  • 檀建新;李志辉;张莹莹;申培立;张蕴哲;任蓓蕾;亢春雨;于宏伟;卢海强;马雯;张伟;陈中义 - 河北农业大学
  • 2015-04-24 - 2019-04-09 - C12N15/75
  • 本发明公开了属于生物技术领域的一种高效穿梭表达载体及其构建方法与应用。本发明是在E.coli‑B.subtilis穿梭载体pHT315的基础上构建的,通过将枯草芽孢杆菌Bs168的木糖启动子序列与来自E.coli表达载体pET21b的T7表达区序列融合,构建了一个高效穿梭表达载体pHTL,以gfp,gus和lipa为报告基因,检测载体的表达能力和遗传稳定性;同时,将来自纳豆芽孢杆菌的碱性蛋白酶信号肽序列代替载体pHTL上的T7肽编码区,构建成高效分泌型穿梭表达载体pHTZ,以gus,tgl1和lipa为报告基因,检测载体的表达能力。两种载体均可以正确表达相应蛋白并具有生物学活性,具有广泛的应用前景。
  • 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法-201610122595.7
  • 吴敬;段绪果;张康 - 江南大学;江南大学(如皋)食品生物技术研究所
  • 2016-03-03 - 2019-03-19 - C12N15/75
  • 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法,属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf,该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA,可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链,然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组,在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养,泡沫显著减少,证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。
  • 一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法-201811241708.0
  • 刘延峰;堵国成;田荣臻;陈坚 - 江南大学
  • 2018-10-24 - 2019-02-26 - C12N15/75
  • 本发明公开了一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法及应用,属于基因工程技术领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主,通过在目的蛋白N端编码基因前添加通过特定方法设计的氨基酸序列,并在质粒中游离表达,使重组枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量提高至改造前的397倍,降低至改造前的1.94%。这为枯草芽孢杆菌基因蛋白高效表达和基因工程改造奠定了基础。
  • 高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法-201811258055.7
  • 张佑红;周文科;田莉;钱泽栋 - 武汉工程大学
  • 2018-10-26 - 2019-02-01 - C12N15/75
  • 本发明公开了一种高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法。以纳豆芽孢杆菌基因组为PCR扩增模板,利用PCR技术获得纳豆激酶基因片段;用BamH I和Sma I双酶切纳豆激酶的基因片段和质粒pHT43;纳豆激酶DNA片段与经过双酶切的质粒载体进行酶连接,得到重组载体pHT‑NK;将重组载体pHT‑NK转化枯草芽孢杆菌,筛选阳性重组子,即获得纳豆激酶转基因工程菌株。采用枯草芽孢杆菌缺陷型菌株为宿主细胞,构建纳豆激酶基因工程菌株,采用这样的菌株发酵不仅纳豆激酶产量高,而且发酵产物杂蛋白少,简化后期分离纯化工艺流程,节约生产成本。
  • 一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用-201410654343.X
  • 武刚;祝发明;刘文庆;朱剑 - 张掖奥谱生物科技有限公司
  • 2014-11-18 - 2019-01-25 - C12N15/75
  • 本发明提供一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用。构建方法包括如下步骤:1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因;2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因;3)分别对步骤1)和2)的表达操纵子基因进行双酶切,构建入载体pBluescriptⅡSK(+),得到重组质粒;4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA,扩增其启动子p43,采用T载体克隆得到含启动子基因质粒,构建入质粒pGJ103,得到质粒pGJ284;通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因,构建入质粒pGJ284,得到质粒pGJ288;5)分别对上述重组质粒和质粒pGJ288进行双酶切,回收酶切产物后连接,得到蜜蜂肽表达载体。该表达载体表达量高,并且蜜蜂肽的提取方法简便,适合工业化大规模制备。
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