[发明专利]UBQ10和GAPDH作为水稻条纹病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明运用geNorm和NormFinder软件鉴定了感水稻条纹病毒(Rice strip virus，RSV)植株中荧光定量PCR的内参基因组合，UBQ 10和GAPDH作为RSV侵染植株中基因功能分析的双内参基因，明显优于单个内参基因的校正效果，可应用于RSV侵染植株基因功能研究，属于分子生物学领域。

背景技术：

水稻条纹叶枯病，病原为水稻条纹病毒，是一种由介体昆虫灰飞虱以持久性经卵方式传毒。水稻感染RSV后引起死苗，减产严重，除水稻外，还危害小麦等作物。20世纪60、90年代后期该病害在华北、华东等地暴发成灾，近年来，感病品种的广泛种植及稻麦轮作方式的推广和冬季气候变暖等环境条件的变化使传毒介体灰飞虱的发生量不断上升，导致该病害在华东稻区大面积发生。迄今为止，几乎没有能有效防治病毒病的化学药剂，治虫防病的应急措施无法作为一项长期策略，而研究寄主在病毒侵染后基因的功能进而病害防控中加以利用则是一种更为环保的手段。要获得准确和可靠的基因表达结果首先需要有用于数据校正的内参基因，也有利于不同研究间数据的借鉴与比较。用于校正和标准化的内参基因必需在任何条件下是持续且稳定的表达，否则就会导致错误的结果，现有的研究多以TIP41-Like等单个基因作为内参基因，其在不同处理时可能会有稳定性问题，有必要尽快确立一种合适的内参基因体系以解决这一问题。

发明内容：

本发明针对上述研究背景，以接种水稻条纹病毒的日本晴水稻为材料对常用的内参基因进行分析，发现UBQ 10和GAPDH是表达最稳定的基因，以这两个基因作为RSV侵染后水稻中基因功能分析的内参基因组合，明显优于单个内参基因的校正效果。

本发明所提供的水稻条纹病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因组合，是通过以下方法获得的：

1)用荧光定量PCR的方法，对接种水稻条纹病毒的日本晴水稻以14对水稻中常用内参基因的表达及其相关引物的特异性进行评估；

2)运用geNorm程序评估候选内参基因表达的稳定性；

3)通过NormFinder软件验证geNorm程序的运算结果；

4)依据geNorm程序可以计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对差异V值，其默认阈值为0.15。根据Vn/n+1比值可以判断引入一个新内参基因是否会对标准化因子产生显著影响，如果Vn/n+1大于0.15，则需要再引入第n+1个内参基因；如果Vn/n+1小于0.15，则不必再引入新的内参基因；

5)RSV侵染条件下荧光定量PCR多内参和单内参校正的数据分析比较，验证多内参基因的组合是否优于单内参基因。

在RSV侵染的条件下鉴定的用于校正荧光定量PCR最合适的内参基因UBQ 10和GAPDH的应用范围包括：RSV侵染植物中病毒的定量；RSV侵染植株中相关基因的表达分析以及RSV侵染植株模式的研究。

本发明能为在RSV侵染植株中获得准确和可靠的基因表达结果提供理论依据，其结果可以用于研究RSV侵染植株基因功能。

附图说明：

图1荧光定量PCR扩增的特异性分析。(A)候选内参基因的溶解曲线图，实验有三次生物学重复，溶解曲线呈单峰；(B)2％琼脂糖凝胶电泳检测候选内参基因扩增的特性条带；(C)2％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量；

图2候选内参基因的表达水平分析。(A)14个候选内参基因的平均Ct值；(B)比较RSV侵染植株与对照(不侵染)植株中14个候选内参基因的表达水平，注：Ct values：Ct值；

图3RSV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的geNorm分析，注：Average expression stability values(M)：内参基因表达稳定性平均值(M)，pairwise variation(V)：配对差异值(V)；

图4RSV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的NormFinder分析，注：Average expression stability values(M)：内参基因表达稳定性平均值(M)；

图5RSV侵染条件下OsPR1b和OsWRKY基因表达在多内参或单内参条件下的数据分析比较，注：Relative expression levels：相对表达水平。

具体实施方式：

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1，RSV侵染植株中基因功能分析内参基因组合的获得