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公布日期
2020-09-11 公布专利
2020-09-08 公布专利
2020-09-04 公布专利
2020-09-01 公布专利
2020-08-28 公布专利
2020-08-25 公布专利
2020-08-21 公布专利
2020-08-18 公布专利
2020-08-14 公布专利
2020-08-11 公布专利
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[发明专利]UBQ10和GAPDH作为水稻条纹病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因及其应用在审

技术领域:

发明运用geNorm和NormFinder软件鉴定了感水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)植株中荧光定量PCR的内参基因组合,UBQ 10和GAPDH作为RSV侵染植株中基因功能分析的双内参基因,明显优于单个内参基因的校正效果,可应用于RSV侵染植株基因功能研究,属于分子生物学领域。

背景技术:

水稻条纹叶枯病,病原为水稻条纹病毒,是一种由介体昆虫灰飞虱以持久性经卵方式传毒。水稻感染RSV后引起死苗,减产严重,除水稻外,还危害小麦等作物。20世纪60、90年代后期该病害在华北、华东等地暴发成灾,近年来,感病品种的广泛种植及稻麦轮作方式的推广和冬季气候变暖等环境条件的变化使传毒介体灰飞虱的发生量不断上升,导致该病害在华东稻区大面积发生。迄今为止,几乎没有能有效防治病毒病的化学药剂,治虫防病的应急措施无法作为一项长期策略,而研究寄主在病毒侵染后基因的功能进而病害防控中加以利用则是一种更为环保的手段。要获得准确和可靠的基因表达结果首先需要有用于数据校正的内参基因,也有利于不同研究间数据的借鉴与比较。用于校正和标准化的内参基因必需在任何条件下是持续且稳定的表达,否则就会导致错误的结果,现有的研究多以TIP41-Like等单个基因作为内参基因,其在不同处理时可能会有稳定性问题,有必要尽快确立一种合适的内参基因体系以解决这一问题。

发明内容:

本发明针对上述研究背景,以接种水稻条纹病毒的日本晴水稻为材料对常用的内参基因进行分析,发现UBQ 10和GAPDH是表达最稳定的基因,以这两个基因作为RSV侵染后水稻中基因功能分析的内参基因组合,明显优于单个内参基因的校正效果。

本发明所提供的水稻条纹病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因组合,是通过以下方法获得的:

1)用荧光定量PCR的方法,对接种水稻条纹病毒的日本晴水稻以14对水稻中常用内参基因的表达及其相关引物的特异性进行评估;

2)运用geNorm程序评估候选内参基因表达的稳定性;

3)通过NormFinder软件验证geNorm程序的运算结果;

4)依据geNorm程序可以计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对差异V值,其默认阈值为0.15。根据Vn/n+1比值可以判断引入一个新内参基因是否会对标准化因子产生显著影响,如果Vn/n+1大于0.15,则需要再引入第n+1个内参基因;如果Vn/n+1小于0.15,则不必再引入新的内参基因;

5)RSV侵染条件下荧光定量PCR多内参和单内参校正的数据分析比较,验证多内参基因的组合是否优于单内参基因。

在RSV侵染的条件下鉴定的用于校正荧光定量PCR最合适的内参基因UBQ 10和GAPDH的应用范围包括:RSV侵染植物中病毒的定量;RSV侵染植株中相关基因的表达分析以及RSV侵染植株模式的研究。

本发明能为在RSV侵染植株中获得准确和可靠的基因表达结果提供理论依据,其结果可以用于研究RSV侵染植株基因功能。

附图说明:

图1荧光定量PCR扩增的特异性分析。(A)候选内参基因的溶解曲线图,实验有三次生物学重复,溶解曲线呈单峰;(B)2%琼脂糖凝胶电泳检测候选内参基因扩增的特性条带;(C)2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量;

图2候选内参基因的表达水平分析。(A)14个候选内参基因的平均Ct值;(B)比较RSV侵染植株与对照(不侵染)植株中14个候选内参基因的表达水平,注:Ct values:Ct值;

图3RSV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的geNorm分析,注:Average expression stability values(M):内参基因表达稳定性平均值(M),pairwise variation(V):配对差异值(V);

图4RSV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的NormFinder分析,注:Average expression stability values(M):内参基因表达稳定性平均值(M);

图5RSV侵染条件下OsPR1b和OsWRKY基因表达在多内参或单内参条件下的数据分析比较,注:Relative expression levels:相对表达水平。

具体实施方式:

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1,RSV侵染植株中基因功能分析内参基因组合的获得

1、植物材料、病毒分析以及侵染方法

水稻种子(日本晴)首先用0.1%HgCl2消毒1小时;然后用去离子水冲洗干净,25℃浸种一天,催芽一天;催芽后的种子用木村B培养液中培养,光照14小时,黑暗10小时,温度28±1℃。

2005年4-5月从江苏海安重病区中采集灰飞虱若虫,在感病品种武育粳3号上进行饲养,交配后单头雌虫单独产卵,再采用斑点免疫结合法检测雌虫带毒情况,保留带毒雌虫的后代,饲养2-3代后获得灰飞虱群体,选择带毒率大于50%的群体分别饲养,获得RSV传毒介体灰飞虱群体H,连续5代监测其群体带毒率均大于50%。

接种前每批虫中随机取出100头经DIBA方法(江苏农业科学,2004,(1):50-51)测定其带毒率,用于测算有效接种虫量[有效接种虫量(虫)=接种虫量(虫)×带毒率(%)]。14天大小的幼苗按有效接种虫量4头/苗接种灰飞虱;接毒3天后,移除灰飞虱,将幼苗移栽到大田中;取接病毒后7、14、21天的水稻叶片保存在-80℃冰箱中做后续研究(RT-PCR方法确认侵染是否成功)。

2、RNA提取

总RNA按照说明书用Trizol提取,并用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度和质量。只有260/280的比值在1.9和2.1之间且260/230的比值大于2.0的RNA可以用作后续的实验。RNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测,所有的样品都标准化到同一浓度,用于后续的实验。

3、反转录和荧光定量PCR分析

用2μg的总RNA作为模板,oligo(dT)作为引物,M-MLV为反转酶合成cDNA。荧光定量PCR操作,运用Bio-Rad iQ5荧光定量PCR系统,SsoFast Eva Green Supermix(Bio-Rad)为荧光染料。本发明所选的14对内参基因(表1)以及OSPR1b和OSWRKY引物的特异性用溶解曲线分析。

荧光定量PCR的体系为20μL,包含10μL SsoFast Eva Green Supermix、0.5μL正向和反向引物、0.5μL cDNA模板。PCR程序为95℃ 10min;95℃ 10s,56℃ 20s,40个循环;在56℃检测SYBR Green吸光值,所有的引物都有三次重复。

表1 本研究所选用的内参基因以及其引物序列

4、内参基因的筛选

候选内参基因的表达稳定性用geNorm和NormFinder分析。引物的表达水平通过荧光定量PCR所得到的Ct值来评估。两种分析方法分析之前,都需要将Ct值值转化为每一基因在表达量最高样品中的相对表达值。利用geNorm软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析;随后用NormFinder软件确认表达最稳定的基因。

我们首先评估内参基因表达的稳定水平,使用NCBI设计了14对常用的内参基因的引物,基因名、登陆号、基因注释以及引物序列都在表1中。溶解曲线和琼脂糖凝胶分析证明每对引物都得到单一的扩增产物,引物的特异性很高,所以这些基因可用于荧光定量PCR验证(图1A,B);其次在实验之前验证RNA的质量和完整性是十分必要的,用NanoDrop 2000分光光度计检测了总RNA的质量,琼脂糖电泳分析表明RNA是完整的(图1C)。

最后通过分析候选内参基因在RSV侵染过程中的相对表达水平,发现不同的内参基因表现出不同的表达水平。Ct值的范围在14-30之间,大多数都分布在22-28之间,18S rRNA和UBQ10的表达水平比其它的基因要高,然而β-TUB是表达水平最低的基因(图2A)。由于内参基因的表达水平在不同的处理条件下是不同的,我们分析了在病毒侵染下这些候选基因的表达是否改变。我们比较了RSV以及对照组Ct值的变化水平(图2B),结果表明,每个基因在不同的处理条件下的表达时稳定的且在个处理中都表现出相同的表达水平。

内参基因表达的稳定性可以通过相关的软件进行分析计算。geNorm程序是由Vandesompele等(2002)开发的用于RT-qPCR内参选择的常用程序之一。该程序可以计算出显示内参基因表达稳定性的M值,M值越大表明基因表达越不稳定,反之则稳定性越好。结果表明UBQ 10和GAPDH是最稳定的基因,随后是EXP,UBC和18S rRNA是最不稳定的两个基因(图3A)。

申请号: 201510323270.0 申请日: 2015-06-09
公开/公告号: CN104975085A 公开/公告日: 2015-10-14
申请/专利权人: 江苏省农业科学院
发明/设计人: 周彤;周益军;方鹏;杜琳琳;兰莹;孙枫;刘之洋
主分类号: C12Q1/68
分类号: C12Q1/68
搜索关键词: ubq10 gapdh 作为 水稻 条纹 病毒 侵染 植株 基因 功能分析 内参 及其 应用
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