[发明专利]用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物在审
申请号: | 201480053360.6 | 申请日: | 2014-08-22 |
公开(公告)号: | CN105579587A | 公开(公告)日: | 2016-05-11 |
发明(设计)人: | 里卡德·桑德伯格;西莫内·佩斯里;欧麦德·R·法瑞达尼 | 申请(专利权)人: | 惠氏公司 |
主分类号: | C12P19/34 | 分类号: | C12P19/34;C07H21/04 |
代理公司: | 北京派特恩知识产权代理有限公司 11270 | 代理人: | 浦彩华;姚开丽 |
地址: | 美国*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 使用 模板 转换 反应 进行 cdna 合成 单细胞 转录 概况 分析 方法 组合 | ||
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月23日提交的美国临时专利申请序列号61/869,220的优先 权,该申请的内容通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及用于以改善的收率和平均长度合成双链cDNA的方法、以及合成的cDNA 分子和由个体细胞产生的cDNA文库。
背景技术
单细胞基因表达分析具有表征细胞异质性的前景,但是目前的方法牺牲了覆盖度、灵敏度或通量。存在若干用于由大量RNA构建全长cDNA的方法,包括帽富集过程(capenrichmentprocedure)(丸山·K.(Maruyama,K.)和菅野·S.(Sugano,S.),基因(Gene)138,171–174(1994);卡宁奇·P.(Carninci,P.)和林崎·Y.(Hayashizaki,Y.),酶学方法(Meth.Enzymol.)303,19–44(1999);达什·M.(Das,M.)等人,生理基因组学(Physiol.Genomics)6,57–80(2001)),但是由单细胞量RNA获得全长覆盖度仍然是具有挑战性的。现有方法使用cDNA的3′端polyA加尾(例如,唐F.(Tang,F.)等人,自然方法(Nat.Methods)6,377–382(2009);笹川·Y.(Sasagawa,Y.)等人,基因组生物学(GenomeBiol.)14,R31(2013))或模板转换(朱Y.Y.(Zhu,Y.Y.)等人,生物技术(BioTechniques)30,892–897(2001);拉姆斯科尔德·D.等人,自然生物技术(Nat.Biotechnol.)30,777–782(2012)),而其他方法由于早期多重化完全牺牲了全长覆盖度(伊斯兰·S.(Islam,S.)等人,基因组研究(GenomeRes.)(2011)doi:10.1101/gr.110882.110;哈希姆绍尼T.(HashimshonyT.)等人,细胞报告(CellRep.)2,666–673(2012))。最近已经表明,与polyA加尾方法相比,依赖模板转换的Smart-Seq在整个转录物上具有更加均匀的读段覆盖度(拉姆斯科尔德·D.等人,自然生物技术30,777–782(2012)),与模板转换在设计来直接捕获RNA5′端的应用中的常见使用一致,这些应用包括nanoCAGE(普莱西C.(Plessy,C.)等人,自然方法7,528–534(2010))和STRT(伊斯兰S.等人,基因组研究(2011)doi:10.1101/gr.110882.110)。利用模板转换的单细胞应用依赖于逆转录、模板转换反应以及统一聚合酶链式反应(PCR)预扩增的效率来获得足量的代表性cDNA以用于测序。尽管广泛使用这些反应,但是尚未报道由单细胞量改善cDNA文库收率和平均长度的系统性努力。
发明内容
本发明提供用于合成cDNA的改进方法,具体而言,在逆转录中,利用模板转换反应 进行单细胞应用的模板转换和预扩增,以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长 度。结合这些差异的单细胞转录组分析具有改善的灵敏度和准确度,并且偏差较少且更易 进行成本有效的自动化。
确切地讲,为了改善由单细胞进行的全长转录组概况分析,本申请披露了在cDNA文库收率和长度方面对逆转录、模板转换寡核苷酸(TSO)以及PCR预扩增的大量变型的评估、以及这些结果与商用Smart-Seq(以下称为)的比较。在此披露的改进出人意料且显著地增加了从少至1ng的启动总RNA获得的cDNA的收率和长度。
在一个实施例中,本发明提供了一种用于制备与RNA分子互补的DNA的方法,该方 法包括在包含锁核酸残基的模板转换寡核苷酸(TSO)的存在下进行逆转录反应。
在另一个实施例中,本发明提供了一种增加cDNA收率的方法,包括在cDNA合成中 使用诸如甲基基团供体的添加剂。在一个实施例中,该甲基基团供体是甜菜碱。
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