[发明专利]气相色谱-质谱检测细胞内中氨基酸的方法无效

专利信息
申请号: 201310648741.6 申请日: 2013-12-05
公开(公告)号: CN103675177A 公开(公告)日: 2014-03-26
发明(设计)人: 陈东;梁远雄 申请(专利权)人: 柳州联海科技有限公司
主分类号: G01N30/88 分类号: G01N30/88;G01N30/06
代理公司: 广西南宁汇博专利代理有限公司 45114 代理人: 邓晓安
地址: 544130 广西壮族自治区柳州*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 色谱 检测 细胞 内中 氨基酸 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属于生物化学检验测定技术领域,特别是涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内中氨基酸的方法。

背景技术

在利用气相色谱-质谱检测氨基酸代谢物方面,目前已有相关技术报道,如专利201210046953.2,公布了一种气相色谱-质谱检测尿氨基酸的方法,包括如下步骤:(1)对待检尿液样本完成尿酶处理;(2)加入内标品,采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理,将样本吹干;(3)对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理;(4)采用上述1-3的步骤处理标准氨基酸,得到标准氨基酸样本;(5)采用气相色谱-质谱联用仪对标准氨基酸样本和待检尿液样本进行检测;(6)以标准氨基酸样本的检测结果作为参比曲线,用常规算法对待检尿液样本的氨基酸进行定量。该专利发明主要应用领域为尿样检测,且该检测方法仅局限于氨基酸代谢物的检测。

对于微生物胞内、胞外代谢物的检测研究,可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律,尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升,而且可确定菌体内的代谢通量分布,进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构,实现目标产物高效生物合成。

目前对于细胞内的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质,不可实现多类代谢物同时检测。由于细胞内各成分含量复杂多样,对于样品的处理方法很关键,目前还没有相关细胞内、细胞外代谢物的系统处理检测方法,使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法,鉴定各种谱峰对映的化合物结构,以及与其它虚拟模型的整合,成为微生物代谢组研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸的方法,弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白,克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。

本发明的方案是通过这样实现的:一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸的方法,检测方法步骤包括:

(1)取发酵液,高速离心,分别收集菌体和上清液Ⅰ;

(2)细胞内代谢物样品制备:取步骤1)得到的菌体,用生理盐水清洗2~3次,冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解,得到裂解液,低温萃取裂解液,离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ,加入内标物核糖醇溶液,裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg,室温真空烘干,得到细胞内代谢物样品Ⅰ;

(3)样品衍生:在步骤2)得到的样品Ⅰ中,分别加入50~150ul糖衍生剂,恒温放置1.5~4h,再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂,恒温放置过夜,衍生完毕,离心衍生后的样品Ⅰ,收集上清得到待测胞内样品Ⅰ;

(4)利用气相色谱-质谱对步骤3)得到的待测胞内样品Ⅰ,进行分析和数据采集。

作为本发明的进一步限定,所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.5~1.0g/ml;所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃;所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。

作为本发明的进一步改进,所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得;所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

作为本发明的进一步改进,所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱,进样口温度300℃,检测器温度250℃,柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min,进样体积1μL;质谱:离子源EI,检测器为四级杆,电离能70 eV,离子源表面温度280℃。

作为本发明的进一步改进,该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的氨基酸。

作为本发明的进一步改进,其特征在于,所述氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。

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