[发明专利]一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体有效

专利信息
申请号: 201180001670.X 申请日: 2011-02-16
公开(公告)号: CN102333870A 公开(公告)日: 2012-01-25
发明(设计)人: 张庆利;黄倢;刘笋;刘庆慧;史成银;梁艳 申请(专利权)人: 中国水产科学研究院黄海水产研究所
主分类号: C12N15/63 分类号: C12N15/63;C12N15/67
代理公司: 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 代理人: 张中南
地址: 266100 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 提高 蛋白 表达 效率 方法 载体
【说明书】:

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体。

背景技术

外源基因在宿主细胞中的表达水平受多种因素的影响,如目的基因本身特性、转录效率、mRNA稳定性、翻译效率、蛋白质稳定性等等。目的基因序列本身的特征,如稀有密码子、终止子、二级结构等常会影响其蛋白的表达水平;如果目的基因含有较多的稀有密码子,常会造成重组蛋白的表达水平较低(Sorensen et al.,1989,J.Mol.Biol.207,365-377);如果稀有密码子集中出现在氨基端,则情况更为严重(Chen and Inouye,1990,Nucl.Acids Res.18,1465-1473);目的基因中碱基突变会产生意外的终止密码子从而导致蛋白翻译水平的下降;mRNA转录子中复杂的二级结构也会干扰翻译的起始和延伸(Tessier et al.1984,Nucl.Acids Res.12,7663-7675;Looman et al.1986,Nucl.Acids Res.14,5481-5496)。尽管目的基因mRNA的转录水平与其蛋白水平不完全一致,但目的基因mRNA的高转录效率和高转录产物的稳定性会在不同程度上提高目的蛋白的表达水平;另外,重组蛋白的翻译效率不仅受目的基因序列本身的影响,也受载体序列的影响。重组蛋白的稳定性也会影响其在宿主细胞中的存在量。

外源目的基因的mRNA在宿主细胞中进行表达时,宿主细胞中tRNA的数量直接反映了该宿主物种mRNA的密码子偏倚性;一个或多个tRNA的稀有或缺少可能导致翻译的停止,tRNA不足可能导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配(Ikemura 1985,Mol.Biol.Evol.2,13-34);尽管少量稀有密码子的出现通常不会对目的蛋白的合成造成太大影响,但是如果一个基因中含有成串或多个稀有密码子时,外源蛋白的表达将非常低、很难检测到,因此目的基因中含过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因(Blake RD et al.1984,J.Biomol.Stuct.Dyn.2,593-606;Robinson M et al.,1984,Nucleic.Acids Res.12,6663-6671);而当在宿主菌中增加同类tRNA时那些含有稀有密码子基因的蛋白质产量将大大提高(Brinkmann U et al.1989,Gene,85,109-114.)。所以人们在进行外源目的基因重组表达时,常对外源基因的序列进行改造,通过调整基因序列三联密码子最后一个碱基减少稀有密码子出现的频率以获得高的蛋白表达量;目前尚未见有人工改变目的基因起始密码子后紧邻氨基酸组成以提高蛋白表达量的文献或专利

在影响外源基因表达水平的诸多因素中,表达载体的作用不可忽视,因为它不仅决定了重组质粒的拷贝数,也严重影响着mRNA的转录效率及稳定性、翻译起始的效率和重组蛋白的稳定性。研究发现,能够高效表达某一基因的表达载体对另一基因而言可能并不合适;所以在外源基因的重组表达中,往往需要根据实际情况,选择合适的表达调控元件,构建合适的表达载体。一般来说,构建的表达载体应满足以下要求:(1)蛋白表达量高,(2)宿主适用范围广,(3)表达的产物容易纯化。其中重组蛋白的表达量是优先考虑的指标。目前有关如何构建高效表达载体已有很多报道,研究多集中在重组质粒的元件包括启动子、多克隆位点、终止密码、融合蛋白标签、复制子、筛选标记/报告基因等方面,尚检索不到利用一些氨基酸的多密码子特性在起始密码子后添加人工序列构建高效表达载体的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体,即应用本发明的方法或表达载体可提高外源基因在宿主中的表达效率,使目的基因获得高效率的表达,以弥补现有技术的不足。

本发明根据生物体内常见氨基酸的密码子简并情况,在重组表达相关基因时在目的基因起始密码子或表达载体序列起始密码子后引入一定数目的编码多密码子(4个或以上密码子)氨基酸的核苷酸序列,这些编码多密码子氨基酸的核苷酸,其对应的tRNA含量丰富,可以快速运送相应氨基酸参与蛋白合成,从而避免目的基因序列或载体编码序列对应tRNA缺乏所导致的mRNA翻译延迟、移码或停止,有效提高翻译的起始、延伸效率,大大提高目的基因或载体融合的蛋白表达效率。

本发明技术方案如下:

一种提高蛋白表达效率的表达载体,该表达载体起始密码子ATG后含有一段编码特定氨基酸片段的核苷酸,其特征在于:

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