[发明专利]一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统在审
| 申请号： | 201711285024.6 | 申请日： | 2017-12-07 |
| 公开（公告）号： | CN109897825A | 公开（公告）日： | 2019-06-18 |
| 发明（设计）人： | 袁正宏;邬敏;张小楠;陈捷亮 | 申请（专利权）人： | 复旦大学;上海市公共卫生临床中心 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/51 |
| 代理公司： | 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268 | 代理人： | 吴桂琴 |
| 地址： | 200433 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统，本发明利用转座子系统，将两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组整合入HepG2细胞，获得整合有不同拷贝数HBV基因组的克隆株HepG2‑HBV/loxP细胞系，其本身不表达HBsAg，当通过腺病毒转导引入Cre酶后，即生成rcccDNA并表达HBsAg，HBsAg的表达与rcccDNA的产生和水平密切相关；rcccDNA的生成快速且稳定，结构特征与真实HBV cccDNA类似，可以支持病毒的转录、复制和蛋白表达；所述rcccDNA可通过设计特异引物利用定量PCR定量检测，以及利用地高辛标记系统行Southern Blot检测。本发明建立的细胞系统可用于建立HBV cccDNA相关生物学研究和抗HBV药物的筛选和评价的平台。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞系统 乙型肝炎病毒 地高辛标记 动物细胞系 基因组整合 生物学研究 抗HBV药物 转录 蛋白表达 定量检测 特异引物 定量PCR 单拷贝 拷贝数 腺病毒 转座子 可用 位点 整合 转导 微生物 复制 克隆 病毒 筛选 引入 检测 | ||
【主权项】：
1.一种产生HBV(r)cccDNA的细胞系统，其特征在于，通过下述方法建立HepG2‑HBV/loxP细胞系：①质粒构建：pSBbi‑rcccDNA质粒由pSBbi‑GP载体质粒(Addgene#60511)插入两端带有loxP位点的HBV单拷贝基因组构建成；pCMV‑SB100为Cre重组酶表达质粒(Addgene#34879)；②细胞转染：HepG2细胞以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)培养，将处于生长对数期的细胞，胰酶消化、计数，按1×106细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养过夜，待细胞约80‑90％融合成片时用于转染，按照每孔转染2μg的量，将1.8μg pSBbi‑rcccDNA与0.2μg pCMV‑SB100稀释于100μl纯DMEM培养液中，同时将100μl纯DMEM培养液与12μl PEI转染试剂混合，将稀释后的PEI与质粒混和，室温静置20分钟，将混合物均匀滴加入6孔板中，8小时后更换新鲜培养液，继续培养；③克隆筛选：转染后48小时后，扩大培养至10cm培养皿，待细胞贴壁后加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，每3天换液一次；4周后，嘌呤霉素抗性单克隆形成，挑取单克隆至96孔培养板扩大培养，每4天传一代，以高糖DMEM培养液(含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1μg/ml嘌呤霉素)培养，批量冻存；④检测HBV基因组整合拷贝数：采用EasyPure Genomic DNA kit(#EE101)抽提基因组DNA，定量PCR试剂采用Thunderbird SYBR qPCR Mix，扩增仪采用StepOnePlus，HBV序列以引物5’‑ATGACCGAGTACAAGCCCACGGT‑3和5’‑TTCGAATCAGGCACCGGGCTT‑3’进行扩增，同时扩增19号染色体基因组上相同长度序列作为内参。
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- 本发明涉及一种异种器官移植基础供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因，并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46多基因修饰的异种移植供体基础猪。本发明在一定程度上解决了异种器官移植中存在的抗原抗体免疫排斥反应及补体调节的共性问题，为在基础供体猪的基础上研究开发适合心脏、肾脏、肝脏等器官及胰岛、皮肤等组织特异性的异种器官移植供体猪的构建奠定了基础，对构建多基因修饰的异种移植供体猪具有重要的应用价值和应用前景。
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- 本发明涉及一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因后并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，再在此基础猪的Rosa26位点再定点插入hCD39、hTBM两个心脏功能修饰特异基因，构建出多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪再进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。本发明为异种心脏移植提供了可靠的供体猪，为处于终末期的心脏病患者的治疗提供了希望。
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- 本发明涉及一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，在此基础猪上再定点插入hCD39、hTBM、REN三个修饰基因，构建多基因修饰的肾脏异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。本发明为适合异种肾脏移植供体猪的开发提供了科学的理论基础，为肾脏衰竭患者的移植治疗提供了希望。
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- 李华顺;韩昆昆;邓娅;任宝永 - 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
- 2016-04-13 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明公开了一种PD‑1 CAR‑T细胞及其制备方法和应用，采用嵌合抗原受体修饰T细胞的改造方法，将PD‑1‑CD8™‑4‑1BB‑CD3ζ分子在T细胞内表达，该方法制备的CAR T细胞可特异性识别和结合PDL‑1蛋白高表达的肿瘤细胞，可以在制备预防和治疗肿瘤疾病的药物中进行应用。
- Anti ROBO1 CAR-T细胞及其制备和应用-201610237593.2
- 李华顺;董宁;王保垒;任宝永 - 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
- 2016-04-18 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明公开了一种嵌合抗原受体修饰T细胞的改造方法，将SCFV(Anti ROBO1‑FN3)‑ CD8™‑4‑1BB‑CD3ζ分子在T细胞内表达，该方法制备的CART细胞可特异性识别和结合ROBO1蛋白高表达的肿瘤细胞，可以应用于相应肿瘤疾病的预防和治疗。
- 钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法-201710272058.5
- 郭军;江灿 - 暨南大学
- 2017-04-24 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明公开一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法，属于医药技术领域。该方法是通过构建NCX1慢病毒颗粒并转染至iPSCs，辅以丹参酚酸B联合诱导。所述的丹参酚酸B的浓度为1～100μM。本发明证实钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B可有效诱导iPSCs心肌定向分化。丹参酚酸B可有效促进NCX1表达，同时促进心肌标志物α肌动蛋白(α‑actin)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达显著提高。且iPSCs形态可见心肌细胞样梭形改变。iPSCs作为修复急性心肌梗死的种子细胞，具有广阔的应用前景。
- 作为HSP27突变型(S135F)携带者的CMT病的动物模型-201480031672.7
- 金润泰;崔炳玉;郑圣哲;洪永彬;禹昭妍;朴晋模 - 三星生命公益财团;株式会社钟根堂
- 2014-04-01 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明涉及作为HSP27突变型(S135F)携带者的Charcot‑Marie‑Tooth病(CMT)的动物模型，具体而言，本发明涉及用于对CMT治疗剂候选物的效力进行评价的Charcot‑Marie‑Tooth病(CMT)动物模型，该动物模型通过如下方式获得：将表达突变型HSP27蛋白(其中，第135位的丝氨酸被置换为苯丙氨酸)的表达载体注射进小鼠的胚胎，并选择具有所述表达载体的小鼠，以检查所述小鼠是否展现出CMT的表型。
- 专利分类
