[发明专利]一种重组腈水合酶的高效表达方法有效

专利信息
申请号: 201710910450.8 申请日: 2017-09-29
公开(公告)号: CN107916271B 公开(公告)日: 2018-09-28
发明(设计)人: 杨立荣;周海胜;郭法谋;吴坚平;徐刚 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C12N15/70 分类号: C12N15/70;C12N15/60;C12N1/21;C12R1/19
代理公司: 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 代理人: 胡红娟
地址: 310013 浙江*** 国省代码: 浙江;33
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摘要: 发明公开了一种重组腈水合酶的高效表达方法,该方法包括:(1)从原始菌株中克隆得到目的基因;(2)构建重组载体,将重组载体转化至宿主细胞,得到基因工程菌;(3)培养所述基因工程菌,获得重组腈水合酶蛋白;所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成;其中,所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1或4所示,所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.2或5所示。本发明方法通过在腈水合酶结构基因的基础上加入活化元件基因,并采用自诱导培养基培养工程菌,获得了高活力的重组腈水合酶。
搜索关键词: 腈水合酶 活化元件 腈水合酶基因 基因工程菌 高效表达 碱基序列 目的基因 重组载体 基因 诱导培养基 结构基因 宿主细胞 依次连接 原始菌株 工程菌 构建 蛋白 克隆 转化
【主权项】:
1.一种重组腈水合酶的高效表达方法,包括:(1)从原始菌株中克隆得到目的基因;(2)构建重组载体,将重组载体转化至宿主细胞,得到基因工程菌;所述重组载体为pET‑21a(+)、pET‑24a(+)、pET‑28a(+)、pET‑30a(+)或pET‑Duet;所述宿主细胞为大肠杆菌E. coliBL21(DE3);(3)培养所述基因工程菌,获得重组腈水合酶蛋白;其特征在于,所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成;其中,所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示,所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.5所示;步骤(3)中,所述培养的过程包括:将所述工程菌活化后,进行扩大培养,再采用自诱导培养基进行发酵培养;所述自诱导培养基为:0.36 g/L葡萄糖,6.84 g/L甘油,2.04 g/L乳糖,12 g/L酵母抽提物,17.1 g/L Na2HPO4·12H2O,3.0 g/L KH2PO4,0.5 g/L NaCl,1.0 g/L NH4Cl和0.6 g/L MgSO4;所述发酵培养的温度为18~20℃,pH7.0~7.5;所述活化培养的固体培养基为:蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,氯化钠10 g/L,pH7.0,琼脂粉20g/L,卡那霉素的浓度为50 µg/mL;所述扩大培养的培养基为:蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,氯化钠10 g/L,pH7.0,卡那霉素的浓度为50 µg/mL。
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