[发明专利]一种检测蛋白同化激素的量子点标记免疫层析试纸条及其制备方法

摘要

本发明提供了一种检测蛋白同化激素(诺龙，群勃龙，丙酸诺龙，雄诺龙，美雄诺龙)的量子点标记免疫层析试纸条，包括样品垫a、硝酸纤维素膜b、吸水垫c和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫a、硝酸纤维素膜b、吸水垫c；所述的硝酸纤维素膜c上分别包被有诺龙抗原构成的检测线d和羊抗兔二抗构成的质控线e。本发明还公开了这种试纸条的制备方法。发明具有以下突出的优点：1、特异性高，灵敏度好；2、检测成本低。3、操作简便。

主权项

1.一种检测蛋白同化激素的量子点标记免疫层析试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有诺龙抗原构成的检测线d和羊抗兔二抗构成的质控线e，两条线间隔距离为5mm，其特征在于，包括如下步骤：(1)诺龙抗血清纯化，得到被检物多克隆抗体；采用Protein A－Sepharose 4B作亲合层析介质纯化诺龙抗血清，一次性获得接近纯度较高的特异性抗体；具体操作步骤为(a)平衡：用0.2mol/L的磷酸缓冲液冲洗管路，平衡柱子，至基线平稳；(b)上样：用平衡缓冲液将诺龙特异性抗血清等体积稀释后上柱；(c)洗杂：用平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳；(d)洗脱收集：用0.1mol/L pH 2.7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体；当紫外吸收曲线呈上升趋势，收集特异性抗体，并迅速用Tris‑HCl中和抗体至中性；(e)封柱：抗体收集完成后迅速用醋酸缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中和纯化柱，最后用20％乙醇饱和封柱；将纯化收集的抗体，用pH7.4的磷酸缓冲液4℃透析三天后取出，添加0.1％w/v的叠氮钠，用磷酸缓冲液将浓度稀释成1mg/mL，备用；利用该抗体与量子点结合制备诺龙抗体—量子点标记物；(2)制备被检物抗原；准确称取548.8mg诺龙溶于9.0mL无水四氢呋喃，待其完全溶解后，加入400mg丁二酸酐、0.55mL三乙胺和243mgDMAP，将圆底烧瓶在60℃的油浴环境中且要有回流现象的条件下持续反应12小时，反应结束后将溶剂旋蒸至干，得红棕色油状物，然后将其用体积比1/1的有机溶剂石油醚/乙酸乙酯以最少的体积复溶，上样到层析柱上，并用体积比1/1的石油醚/乙酸乙酯为展开剂，将反应物梯度淋洗下来，将最终确定为目的物的淋洗液旋干后得到17β‑NT半抗原，为白色晶体；采用混和酸酐法制备诺龙抗原：准确称取0.01mmol 17β‑NT半抗原，溶于200μL N‑N二甲基甲酰胺溶液中，然后加入2.46μL三正丁胺，反应10min后，再加入1.4μL氯甲酸异丁酯，于冰水浴中避光搅拌反应1h，得A液；称取10.0mg OVA，溶于2.0mL碳酸盐缓冲液，搅拌下缓慢加入上步所得的A液，4℃反应过夜，反应结束后，在4℃下用磷酸盐缓冲溶液透析三天；透析完，取出反应液，记录体积，粗略计算蛋白的浓度并加入叠氮钠，每mL反应液加入5μL叠氮钠，然后分装，置于4℃保存备用；(3)采用活化酯法制备量子点‑抗体偶联物；(4)取适量步骤(3)制备的被检物抗体—量子点标记物，添加于样品溶液中；(5)将步骤(2)制备的被检物抗原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，并将羊抗兔二抗包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；(6)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的蛋白同化激素量子点免疫层析试纸条；所述试纸条用于检测诺龙，群勃龙，丙酸诺龙，雄诺龙和美雄诺龙。